Bt10定性PCR方法.doc.doc

前 言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。 本标准起草单位：农业部科技发展中心、上海交通大学。 本标准主要起草人：张大兵、刘信、杨立桃、沈平。 本标准为首次发布。 转基因植物及其产品成分检测 抗虫玉米定性PCR方法玉米PCR检测方法。 玉米PCR检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T 673 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 术语和定义′ 端与玉米基因组的连接区序列，包括外源插入载体氨苄青霉素抗性基因5′ 端序列和玉米基因组的部分序列。 原理 根据转基因抗虫玉米扩增中是否含有玉米。 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 琼脂糖 10 g/L 溴化乙锭溶液：称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中。 注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作。称取氢氧化钠NaOH）80.0 g，先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL。称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入溶液，加热溶解后，冷却至室温，用溶液调pH至8.0，水定容100 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。称取121.1 gTris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.5）和2 mL溶液，水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。 称取242.2 gTris），先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL溶液，用冰乙酸调pH至8.0，然后水定容到1000 mL。使用时用水稀释成1×TAE。 加样缓冲液称取250 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解；称取250 mg二甲基苯腈蓝，用10 mL水溶解；称取50 g蔗糖，用30 mL水溶解，混合三种溶液，水定容至100 mL，在4下保存。 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。 引物 zSSIIb基因。 zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′； 5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′； 预期扩增片段大小为bp。 Bt10转化体特异性序列。 Bt10-F：5′- CACACAGGAGATTATTATAGGGTTACTCA -3′；5′- GGGAATAAGGGCGACACGG -3′；预期扩增片段大小为bp。 引物溶液 用TE缓冲液（）分别将上述引物稀释到10 μmol/L。 抽样 按NY/T 672和NY/T 673执行。制样 NY/T 672和NY/T 673执行。 试样预处理 NY/T 674规定执行。 NY/T 674规定执行。 每个试样次重复。PCR反应管中按表1依次加入反应试剂用手指轻弹混匀，再加50 μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。 将PCR管离心10 s后插入PCR仪中95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（9472℃延伸30 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当调整）；727 min。 7.5.1.5　反应结束后取出PCR反应管反应产物进行电泳检测。PCR检测反应体系 试剂 终浓度 体积 31.75 μL 10×PCR 缓冲液 1× 5 μL 25 m 2.5 mmol/L 5 μL dNTPs 0.2 mmol/L 1 μL 10 μmol/L 上游引物 0.5 μ 2.5 μL 10 μmol/L 下游引物 0.5 μ 2.5 μL 5 U/μL Taq 酶 0.025 U/μL 0.25 μL 25 /L DNA 模板 1 g/L 2.0 μL 总体积 50 μL PCR 缓冲液玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别为zSSIIb-F和zSSIIb-R；转基因玉米转化体PCR检测反应体系中，上下游引物分别为-F和Bt10-R。 对照PCR反应 PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分与7..1相同。DNA作为PCR反