实验25聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离.doc

实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离 过氧化物酶同工酶 ? 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 一、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。 1. 聚丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺（ Acr ）单体和交联剂 N ， N –亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）有以下两种： （ 1 ）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二胺）系统 在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 [ （ NH 4 ） 2 S 2 O 8 ] 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在 pH 8.8 条件下 7 ％的丙烯酰胺溶液 30 分钟就能聚合完毕；在 pH 4.3 时聚合很慢，要 90 分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近 0 ℃的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混合。 （ 2 ）核黄素– TEMED 系统 这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，核黄素被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。核黄素催化系统的优点是：① 用量极少（ 1 mg/100 mL ），对所分析的样品没有任何影响；② 聚合作用所用的时间可以自由控制，变化光照时间、强度，可使聚合延缓或加速。而过硫酸铵 - TEMED 系统的聚合作用所需的时间除了取决于温度、 pH 及有氧分子或不纯物质的存在外，还取决于它们的浓度。为了使分析的结果重复性高，核黄素催化系统的光照时间和强度最好标准化。 凝胶的机械强度和弹性是很重要的。凝胶的软硬、透明度、粘着度都会直接影响分离的效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度和 Acr 与 Bis 两者之比。 设 T （ Acr 和 Bis 总浓度） ? c （交联剂百分比） 式中： a = Acr 克数； b = Bis 克数； m = 缓冲溶液体积（ mL ）。 其中 a : b （ w ／ w ）是很关键的。当 a : b 10 时，凝胶变脆、变硬、呈乳白色； a : b 100 时， 5 ％的凝胶呈糊状，也易断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制 a : b=30 左右。不同浓度的单体对凝胶性质也有影响，发现 Acr 低于 2 ％， Bis 在 0.5 ％以下就不能聚合了。当增加 Acr 浓度时要适当降低 Bis 的浓度。通常 T 为 2 ％～ 5 ％时， a : b=20 左右； T 为 5 ％～ 10 ％， a : b = 40 左右； T 为 15 ％～ 20 ％时， a : b = 125 ～ 200 。 用于研究大分子核酸的凝胶多为 T = 2.4 ％的大孔径凝胶，因为太软不易操作，最好加入 0.5 ％琼脂糖。有的在 3 ％凝胶中加入 20 ％蔗糖也可增加其机械强度而不影响其孔径大小。至于粘着度，一般说来只要容器内壁干净，单体浓度适中，凝胶与器壁粘着情况令人满意，不会出现样品渗漏。新制备的凝胶与器壁附着力较大，随存放时间的延长附着力降低。 2. 聚丙烯酰胺凝胶的孔径 聚丙烯酰胺凝胶在电泳中不仅有防止对流，减低扩散的能力，而且还具有分子筛的作用，这是因为聚丙烯酰胺凝胶是一个三维空间网状结构。某一个分子通过这种网孔的能力显然取决于凝胶孔径的大小和形状，也取决于被分离物质的大小和形状。