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培训心得之基因型鉴定 刘艺 基因型鉴定基本步骤 DNA提取 PCR反应 DNA提取 所取样本—鼠尾 取样时间 取样过程 动物标记 取样记录 注意事项 取样时间 10d-14d 鼠小，尾尖部DNA充足，出血少，毛少，易操作。 取样过程 器械：眼科剪，小镊子，酒精棉，基因型检测记录表，记号笔，1.5ml EP管（消毒） 减尾长度：1cm左右 小贴士：双人操作，一剪一消毒，两剪同时进行，三序核对，稳准狠 R F 脚标：剪鼠尾的同时，剪去一小段不同脚趾，通过不同脚趾的缺失排布以确定该小鼠的编号。 前肢用字母F（front leg）表示(1-8)， 后肢用字母R（rear leg）表示(1-10)。 思考：第26只小鼠标记是什么？ 动物基因型检测记录表 检测鼠ID 样品准备的注意事项 ①鼠尾最好当天剪完当天进行DNA的提取。 ②如不能提应放至-20℃冰箱保存，但注意冻存时间不宜过长。 ③低温保存的样品不宜反复冻融。 举例：百奥赛图老师们10d剪尾—1周做检测—18d基因型鉴定完毕—分笼 DNA提取的总流程 标注序号 裂解液的 配制 鼠尾裂解 离心去杂质 吸取上层 溶液 异丙醇沉淀 离心洗涤 室温风干 水溶DNA 裂解液的配方 蛋白酶K（PK）：储存浓度：10mg/ml；终浓度100ug/m; -20℃保存。 储存液可以事先配制好，蛋白酶K要现用现配。 配制列子：10ml裂解液 Tris-HCl 1ml EDTA 100ul NaCl 667ul SDS 200ul 蛋白酶K 100ul 10000ul(10ml)-1967ul=8033ul水 提取具体步骤 PCR鉴定 引物设计 条件摸索 常见问题 举例说明 引物设计 设计原则 ①引物长度一般为20~24bp ②引物碱基尽可能随机分布：GC含量约60% ③引物不应有发夹结构：即不能有4bp以上的回文序列 ④引物的3‘端为关键碱基：两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列 ⑤在3’端不应有任何互补碱基 ⑥产物大小：约200~300bp ⑦Tm值：60℃左右 ⑧特异性：即无目的条带之外的多余条带 ⑨最理想的鉴定引物，一对引物即可以区分两种基因型 条件摸索 DNA模板 引物 Mg2+浓度 dNTP Mixture ddH2O 退火温度 温度梯度下如果没有条带，直接换引物吧！ 常见问题 引物是关键： 无扩增产物—引物设计不当或发生降解 非特异性扩增—引物特异性差 原因 对策 重新设计引物吧！ 模板要干净，浓度要合适 无扩增产物：含量低，含有抑制物（酒精没洗干净） 非特异性扩增：模板浓度过高 拖尾现象：模板不纯 模板在加入MIX之前要测定浓度 OD:260/280 纯DNA浓度OD值大约在1.8 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物（水对照，阴性对照）。 原因 被污染了！！！ 1.操作时动作要轻柔 2.器材要高温高压消毒 3.各种试剂事先分装，低温贮存 PCR中对照组的设立 Cre-loxp system Flp-Frt system 基因敲进—Rosa 26 工具鼠查找使用 Cre 一种重组酶，可由噬菌体转染到细胞，催化Loxp位点间的DNA进行特异性重组。 Loxp 34bp序列，两端是13bp的反向重复序列，中间是其定向作用的8bp间隔区。 重组产物 根据loxp位点的位置和相对方向而不同，在一条链上单loxp位点的DNA将被融合。 Cre Loxp Loxp Flp-Frt system:主要用来去除Neo Neo Frt Frt Flp Neo：新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志。 基因敲进—Rosa 26 Rosa 26不编码蛋白质，在其前面加入强启动子，后面加一个过表达的基因便可以实现定点敲进，用于识踪。 Target Neo Neo 后有一个stop序列，所以当Neo存在时，后方的报告基因不表达，Cre敲掉目的基因同时报告基因被敲进。 Loxp Loxp Promotor+Rosa26+gene Frt Frt Cre 工具鼠 含有重组酶（Cre,Flp)的小鼠，可与含（Loxp,Frt)小鼠交配，得到基因敲除/敲进小鼠。 选择工具鼠： 有详细的介绍各种工具鼠。 ①工具鼠