乳铁蛋白的分离纯化.pdf

牛羊马传染病 乳铁蛋白的分离纯化 曲练达1王术德2侯喜林睬，朴范泽1※ (1．黑龙江八一农垦大学预防兽医学教研室163319；2．东北农业大学预防善医学教研室150030) 摘要：乳铁蛋白是一种铁结合性糖蛋白，具有抗茵、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生理功能。因此， 乳铁蛋白应用于食品、医药、饲料和化妆品等领域具有非常广阔的前景。乳铁蛋白的分离纯化方法较多，本 文采用盐析法和层祈法从来源丰富的牛初乳中分离纯化乳铁蛋白，并利用电泳和分光光度法法检测其纯度 和含量，所获得的乳铁蛋白的分子质量为90，000u，纯度大约为92％． 关键词：乳铁蛋白，盐析，凝胶层析，分光光度法 乳铁蛋I匀(Lactoferrin，简称LF)是存在于哺乳动物外分泌液中的一种铁离子结合蛋白， 结构与转铁蛋白相似，但铁结合能力是转铁蛋白的260倍。LF是由689个氨基酸组成的单 一多肽链，分子质量约为78，000～90，000u。LF具有许多独特的生物学功能，增强铁的传递 和吸收、广谱的抗菌性、免疫作用、抗氧化作用、促进肠道菌群的平衡、作为生长因子、抗 炎症、抗病毒、抗癌症作用等【1】。因此，LF作为功能性成分应用于食品、医药等行业具有 广阔的应用和开发前景。 牛初乳本身就是一种功能性食品，含有多种生物活性物质，并且来源丰富，所以，牛初 乳成为提取LF的最适来源之一。自1960年以来，人们就试着采用各种方法来制备LF，如 离子交换层析[6】、色谱、超滤【7】、固定化单克隆抗体[8】、亲和层析等，从人乳或牛乳中分 离 纯化LF，但色谱法和固定化单克隆抗体法虽能获得较高纯度的LF，但价格昂贵，技术 要求高，所以并不适用于工业化生产；超滤法简便费用低，易形成工业化生产，但LF纯度 G．100分离纯化 低，膜需要经常清洗。凌雪平曾经采用2次硫酸铵沉淀和2次sephadex LF，所获得的LF分子质量约为78，000u，纯度达到88％，得到了较好的分离效果，为工业 化生产LF提供了技术依据。本试验首次采用3次盐析和1次凝胶层析的方法从牛初乳中提 取LF，获得了LF的分子质量为90,000u，纯度大约为92％。 1材料与方法 1．1主要仪器设备和试剂 泳仪：北京六一仪器厂；低温高速离心机：himae公司；层析仪：美国BI㈣AD’公司。 牛初乳(第一天)，大庆市泰康奶牛公寓；标准乳铁蛋白，SIGMA；标准分子质量蛋白， 上海生工生物工程技术服务有限公司；硫酸铵，分析纯；SDS．PAGE试剂(电泳级)，进口 分装。 1．2试验方法 乳样前期处理：乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理，即除去脂肪和大量的酪蛋 得到乳清。 盐析：盐析选用硫酸铵沉淀，以除去分子量比较小的蛋白。将乳清用30％的饱和硫酸 时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。 G．100对汴进行分离和纯化。将 凝胶层析：为了获得较高纯度的LF，选用Sephadex 透析后的乳清lmL加入平衡过的凝胶层析柱；在20℃条件下以0．2mL／min的流速进行洗脱， 1．3 LF的鉴定 ．．594．． 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 采用非连续性SDS—PAGE电泳对脱脂乳和盐析分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗 脱产物进行检测。 采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋白的浓度进行测定。 2结果与分析 2．1凝胶层析吸收峰图 本试验凝胶层析选用的洗脱液为pH7．4的PBS，与凌雪平选用pH7．7的PBS不同，由 于LF的pH为7．0～8。0，所以，在这个pH范围内均可以得到LF，根据卢蓉蓉在色谱分离 过程中对不同pH值的PBS下所获得LF的浓度的研究得到，pH7．4的PBS能够获得较高浓 度的LF。由图1可知，峰I显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但是非LF成 分含量却很低，可以忽略，样品纯度比较高，经SDS．PAGE电泳检测仅出现一条可见的区 带，相对分子质量为90，000u，对电泳凝胶进行扫描和计算机分析，LF的纯度达到92％，LF 峰II和峰IlI显示样品的吸收峰峰值较大，说明LF含量较高，但是样品不纯，含有其他成