人角膜内皮细胞系的建立.pdfVIP

福建蔓q 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08。19-23 人角膜内皮细胞系的建立 樊廷俊·付永锋王晶赵君刘万顺丛El山汤志宏韩宝琴于秋涛郭瑞超 中国海洋大学生命科学与技术学部海洋生命学院，青岛266003 摘要：为了建立人角膜内皮细胞系，本文以人角膜为材料对其角膜内皮细胞的体外培养及 其细胞系建立进行了研究。从眼库获取人眼角膜片，采用内皮面朝下贴板培养和时间梯 度连续贴膜法，筛选出仅含有纯净角膜内皮细胞的培养孔，收集角膜内皮细胞悬浮于含 有硫酸软骨素氧化降解物、牛眼生素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、 CEC液、羧甲基壳多糖、N．乙酰葡萄糖盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的DMEM—F12培养液 (20％胎牛血清)中，置C02培养箱中启动原代培养。待角膜内皮细胞长成单层后进行 细胞的特征性染色体数目为46条，但出现了染色体的非整倍性；其细胞的群体倍增时间 约为26．2h。抗神经元特异性内酯酶(NSE)抗体的免疫细胞化学染色和形态回复实验的 研究结果证实，该细胞系确为人角膜内皮细胞系。没有任何致瘤性的HCEC05tjf细胞系 的建立，为人类人造角膜内皮的研制及其应用奠定了基础。 关键词：角膜内皮细胞细胞系染色体数目神经元特异性内酯酶(NSE)人 高等动物角膜内皮层由单层六角形枝状内皮细胞镶嵌而成，这层细胞在成勺i后失去了分 裂能力，局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区…。一日．角膜内皮细胞 密度低‘J二维持内皮绌胞生理功能的临界密度，角膜将出现不可逆之病变【2≯j。角膜病是lU：界上 上要致盲眼病之一，角膜病忠名‘绝大多数可以通过角膜移植而复明，但由J：角膜移植材料的 高度匮乏，在我国等待做角膜移植的120万病人中，只有2000—2500人能接受角膜移植手术， 绝大多数忠者闪符不到移植角膜Ⅲ儿法重见光明【4】。近年来角膜组织T程的兴起，为人造眼 角膜带来了新的希望，但如何在体外状得大景的角膜内皮细胞以及如何研制出一种可降解的 生物相容性好的角膜内皮支架材料，一赢是该领域的研究热点和主攻办向撙J。 次状得纯的新两兰大白兔角膜内皮细胞，i：成功启动了其体外培养16j。随后，学者们先后对兔、 小鼠、大鼠、牛、猪、猫和人角膜内皮细胞的体外培养进行了研究【7。1¨。后来，学者们又对 不同哺乳动物角膜内皮细胞的体外培养条件进行了摸索，发现一些生长l大|予对角膜内皮细胞 41。1993 具有一定的促分裂作用I眩。1 q-，WilsonSE等浮次用猿猴红疱疹病毒(SV40)大T抗 原对人角膜内皮细胞进行了转染，状得了可继代培养的角膜内皮细胞【I引。后来，许多学者也 纷纷利用SV40、淋巴瘤病毒、SV40大T抗原和不同癌基因等对小鼠、兔和人的角膜内皮细 胞进行了转染实验，虽然状得了几个可继代培养的细胞系，但由r具有致瘤性而允法用’Ji人 工角膜的构建和临床角膜移植手术【l昏班】。到目前为止，仍没有不利用转染技术而成功建立哺 乳动物角膜内皮细胞系的报道。 367 穰毽l仃 第三届海洋生物育技术论坛 2005．08．19．23 近年来越来越多的证据显示，角膜内皮来源·1：神经外胚层，而不是中胚层盼241。神经元 enolase，NSE)一直被用作鉴定人眼中神经嵴来源细胞的分子 特异性内酯酶(neuron—specific 标记‘25，261。1994年，ZwaanJ等‘271在晚期鸡胚的神经视网膜和视神经中发现了NSE阳性反应。 1998年，B6hnkeM等【28】在长期培养的人角膜内皮中鉴定到了特异性的NSE阳性反应，得出 了NSE可以用来鉴定长期培养内皮细胞的结论，从而为人们鉴定长期培养的内皮细胞提供出 一个理想的方法。 本文以人眼角膜为材料，对其角膜内皮细胞进行了体外培养和建系研究，旨在建立人角 膜内皮细胞系，为人类人造角膜内皮的研制及其临床应用奠定基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1实验动物：人眼角膜片(由山东省眼科研究所友情提供)。