细胞思考题0215粗制版.docVIP

定量检测几十万个分散的细胞的DNA含量 应用流式细胞检测技术（FCM） 1．.收集单细胞悬液(1 ×106个)，缓慢加入1 ml预冷的70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。 2．离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇； 3．去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 ℃ 染色30min后上机检测。 4．DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量。 看线粒体内外膜结构以及此处的某种蛋白颗粒 看线粒体内外膜结构及蛋白颗粒要用透射电镜。 定量检测一批光镜切片上含有某种蛋白质的细胞的数目 首先对切片上的全部细胞进行针对目的蛋白的荧光探针特异性标记（荧光染色，荧光标记抗体，外源导入荧光蛋白），同时对细胞行核复染。再以荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察。 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关 了解细胞发生死亡时的形态学和某个酶的改变 首选以流式细胞术通过对检测细胞以 Annexin V/PI双染法或亚二倍体(Sub-G1)峰的检测分选出凋亡细胞。 再荧光标记凋亡细胞的要检查的酶，以激光扫描共聚焦显微镜观察酶的变化。 对细胞电子染色后以扫描电子显微镜观察其形态。 了解某个新基因所编码的蛋白质的功能 1.首选以Northern blot检测该蛋白在各组织中的表达。选出表达丰度最高组织细胞。 2．设立该组织细胞的cDNA文库，从中筛选出与该蛋白有相互作用的蛋白（编码基因）。 3.以酵母双杂交法及GSTpulldown方法对所筛选蛋白做验证。 4.由所筛选出的蛋白功能来分析推测该蛋白功能并用分子生化技术及细胞生化技术检测。 透射电子 当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的电子显微镜称为透射电镜。 二次电子 在入射电子的轰击下，样品表面5～50nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的电子显微镜称为扫描电镜。 电子显微镜：电子显微镜镜以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。 分辨率 表示人眼和光学仪器能够辨别两点之间最小距离的标志。 免疫电镜技术 免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。 如果需要了解细胞内部的超微结构变化，请问应选择哪种类型的电镜？ TEM 透射电镜样本取材时必须做到快、小、轻、冷，为什么？ 快：1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。 小： 约1mm3的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。 轻： 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤。 冷： 低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。 没有及时固定的组织细胞透射电镜下会出现何种改变？ 自溶 扫描电镜取材必须注意哪些？ 因为扫描电镜观察的是样品表面结构，必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤要观察的部位，材料要新鲜，取材部位要准确，样品块要尽量小一些，用锋利的刀片，尽快固定。 气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净。 贴壁细胞: 进口玻璃盖玻片1cm×1cm ，生长细胞，缓冲液漂洗，戊二醛固定1～2小时 游离细胞： 玻璃盖玻片表面涂10%多聚赖氨酸（10分 钟），未完全干燥时涂一层细胞（10分钟），戊二醛固定1～2小时 简述激光共聚焦显微镜的工作原理。 在显微镜基础上配置激光光源、扫描装置、共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型荧光显微镜系统。以激光作为激发光源，对样本进行断层扫描，同时采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，最终获得高分辨率光学切片图像的荧光显微镜系统。 简述激光共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？ 光源不同（激光Vs普通光），扫描方式不同（断层扫描VS一次成像），聚焦不同（光源针孔+检测针孔双聚焦VS透镜聚焦），图像采集处理不同（计算机采集处理VS目视） 优点：高水平及垂直分辨率，可经计算机处理成三维结构， 缺点：1.逐点扫描，成像速度慢。 2.观测厚度：50-100μm 3.分辨率极限：0.15μm 简述激光共聚焦显微镜的功能。 观察标记荧光素的样品：1.薄层断层扫描2.多通道同时成像3.ZOOM成像4.多维度成像5.荧光定量分析 负显性突变：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且