高温菌的纯种分离与鉴定范例.pptx

高温菌的纯种分离与鉴定 汇报人:赵影 汇报内容 实验内容 实验结果及分析 实验后期工作 实验内容篇 接着上次的实验结果,老师给的样品{DSM88固体培养基，温度70度，PH7.0}培养长出了菌株 对菌株进行纯种分离 :在培养出的菌株中挑选了10个单菌落{从菌落特怔看为不同的菌种}进行培养,多次划线,直到长出的菌为纯种菌 对得到的10种菌进行斜面保藏及革兰染色观察它们的形态结构{对部分菌进行了芽孢染色} 实验结果篇 10种菌的菌落特征及形态结构(革兰染色,单染色) 2号菌革兰染色图片 2号菌单染色图片 3号菌革兰染色图片 3号菌单染色图片 4号菌革兰染色图片 4号菌单染色图片 5号菌革兰染色图片 5号菌单染色图片 6号菌革兰染色图片 6号菌单染色图片 7号菌革兰染色图片 7号菌单染色图片 8号菌革兰染色图片 8号菌单染色图片 9号菌革兰染色图片 9号菌单染色图片 10号菌革兰染色图片 10号菌单染色图片 实验结果分析篇 对挑取的9种样品进行多次重复划线 内容2 菌种的分子鉴定 细菌 的DNA提取： 实验原理：苯酚 氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性。SPS将细胞膜裂解，在蛋白酶K，EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来，DNA溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液，当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定遭到破坏，变性沉淀，离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两项之间，酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质，氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的溶液用2倍体积的无水乙醇在乙酸钠存在下沉淀DNA。回收DNA用70%乙醇法洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 内容2 实验步骤：1、挑米粒大小菌体+50微升溶菌酶+460微升1×TE,放入37℃摇床2小时以上（注意摇菌时离心管要横放） 2、20％SDS50微升+Pk5--10微升震荡混匀，放入55℃烘箱30~60min 3、550微升苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）震荡混匀，12000rPm离心10min，吸取上清（不吸到中间渣滓，反复抽提2次） 4、上清液+2倍上清液体积无水乙醇+0.1倍体积的乙酸钠，室温放置10min以上； 5、12000rPm离心10min，去上清，用70％乙醇轻摇洗盐1~2次，再次离心5min，弃乙醇 6、37~55℃干燥后（确保乙醇完全挥发干净，防止影响PCR），加水保存备用 50mi 加热使其溶解 定容 TE配制方法：(用于悬浮和贮存DNA) 配制100ml溶液各成分用量 1ml 1mol/L Tris-HCL (pH7.4-8 , 25℃) 200ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 水98.8ml Tris-HCL缓冲液配制： 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸，用水调至终体积1L 浓盐酸体积（ml） pH 70ml 7.4 60ml 7.6 42ml 8.0 0.5mol/LEDTA配制： 93.05gEDTA.Na2+10gNaOH 注：加固体NaoH调pH为8左右固体完全溶解。 20%SDS(50ml) 称取SDS固体10g加去离子水50mi 加热使其溶解 定容