膜蛋白样本制备.ppt

蛋白样本制备与Western Blot 主要内容 一 蛋白样本制备成功蛋白分析的基础 二 蛋白样本制备的原则 二 蛋白样本制备的策略 三 案例分析-- 细胞中总蛋白的制备 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 各类表面活性剂特点 选用表面活性剂考虑的因素 去除未结合的表面活性剂 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 磷酸酶抑制剂选择 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。 常规的抑制剂主要包括： 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 全蛋白抽提时注意事项 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 四 蛋白样本制备产品选择指南 核蛋白样本制备 膜蛋白样本制备 膜蛋白的抽提 方法及原理 方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 产物 细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白 注意事项 根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等. 抑制蛋白酶. 样本量 膜蛋白的直接提取 蛋白的分级提取 亚细胞分级抽提 四种亚细胞组分分离提取的结果 线粒体蛋白样本制备 其它蛋白抽提产品 高丰度蛋白去除试剂盒 信号蛋白提取试剂盒 糖蛋白提取试剂盒 细菌蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 植物蛋白提取试剂盒 五 蛋白定量产品选择指南 BCA法蛋白定量 Bradford法蛋白定量 Lowery法蛋白定量 六 成功的Western Blot 六 成功的Western Blot 蛋白变性 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围 聚丙烯酰胺分离胶配方 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS胶制备注意事项 过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整TEMED的使用量。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。 插梳子的时候要用力均匀，一次成型。 在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。 上样及电泳 提前将样品沸水浴5分钟，12000－14000rpm离心5分钟。 根据自己的设计上样。 80V恒压跑浓缩胶。 看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。 当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4－0.6mm时停止电泳。 转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。 转膜 转膜注意事项 PVDF膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡20分钟。 膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。 转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。 膜的封闭 转好蛋白的膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 显影 显色方法 HRP酶促底物直接显色 显色方法—化学发光 成功的要素 质优量足的蛋白样本 科学的对照 正确的抗体选择 保存和使用 细致的实验操作 步步监测 科学的对照 蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪 阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率 阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性 内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 蛋白Marker WB常用内参及其技术参数 正确的抗体选择 保存和使用 实验细节 步步监测 蛋白样本 定量和SDS考马斯蓝染