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血清成分分析 （Serum component analysis） 朱素素 指导老师：吴明江 实验内容 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） ◆胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对550nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100mL样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。 1.邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇标准曲线及样品的测定数据 2.实验结果 由标准曲线可知： 1.加入邻苯二甲醛试剂的未免疫样品溶液含胆固醇约为（71-51）=20mg/100ml. 2.加入邻苯二甲醛试剂的4号免疫样品溶液含胆固醇约为（100-58）=42mg/100ml. 3.结果分析 ◇可知4号免疫的兔子血清的胆固醇含量比较高。据所查到的资料，免疫系统的激活能阻碍肝脏清除胆固醇的能力 。 4.误差分析 1.因为光的波长不同，其吸光系数亦不同。故应保证同组样品在同一波长下进行测定并注意每次调零操作。 2.血清总胆固醇的测定中受水分影响很大，因此所用试管，比色杯必须干燥。 3.低温下，胆固醇在无水乙醇中溶解度降低，因此用无水乙醇提取胆固醇应在10°C以上的室温下进行。 ◆血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析，透析，浓缩 盐析：高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素——水化膜和胶粒上的电荷，使蛋白质凝聚、沉淀 透析：高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀 浓缩：利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩 离心分离一次，得①上清液（这要是含清蛋白）和②沉淀（主要是含γ-球蛋白 ） ↓ 对①离心，透析，浓缩得较纯清蛋白；对②离心，透析，浓缩得较纯γ-球蛋白 ◆凝胶层析 凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。 凝胶层析的应用 ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。 ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。 ⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。 ⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。 1.实验结果 凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。 本次实验没有测出光度值，是以试管的编号数为横坐标，每一试管的颜色深浅程度为纵坐标描绘的洗脱的曲线，可以有图得知在蓝葡聚糖在第17管达到洗脱峰，重铬酸钾在第36管达到洗脱峰。 2.结果分析 本次实验由于在加蓝葡聚糖和重铬酸钾混合液时，没有等到混合液先沉到洗脱液底部，即凝胶面的表面，就开始加继续加洗脱液进行洗脱，致使混合液被稀释了一些，造成样品扩散加剧、区带变宽，降低了分辨率，而且实验时间会大大延长。 2.误差分析 1.加样前要尽量快速、均匀。另外加样品量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重