帕金森病内源性致病因子研究中的色谱技术应用.pdf

All帕金森病内源性致病因子研究中的色谱技术应用 邓玉林{徐敏 孟令燕杨威 牟晓玲唐力 肖盛元 北京理工大学生命科学与技术学院北京100081 帕金森氏病(PD)是锥外系运动障碍性疾病。该病的病理学特征表现为黑质多巴胺(DA)神 经元进行性不可逆的变性和死亡。随著年龄的增长，黑质多巴胺细胞数减少，其原网归结于 DA的氧化导致氧化应激(oxidative 各种活性氧自由基(reactive 使DA神经元长期暴露在氧化应激下，细胞内蛋白质、核酸、膜脂质等发生变性，并导致细 胞死亡。与这种”生理老化”过程不同，PD是由于发生了”致病”的细胞死亡。至于细胞死亡的 病因尚不清楚。自从1979年发现MPTP可以导致人类产生PD病症以来，外源或内源性的神 经毒素的研究得到了广泛重视。 动物产生类似于PD的症状，并且MPTP引起的脑内损害与PD患者的脑内损害非常类似。由 于MPTP是外源性物质，寻找具有类似MPTP结构且自然存在的PD病因物质具有更重要的 及其类似物在脑内生成和代谢我们提出一个新假说：脑内自由基异常(RP氧化应激)导致脂过氧 化(Lipid 过多步代谢(N．甲基化和氧化)后积累丁线粒体上．从而抑制呼吸链ComplexI活性；ComplexI 的抑制将进一步增加氧自由基的产生，形成恶性循环，最终特异地导致DA经元变性死亡。该 假说首次将异喹啉类神经毒素的形成与氧化应激联系在一起，为解明内源性神经毒素在黑质 神经元变性中的作用提供了新思路。 实验中采用细胞和动物模型来证实该假说，然而如何检测细胞和动物脑组织中salsolinol 及其类似物和代谢物成为本研究的关键问题之一。本论文重点讨论内源性神经毒素在细胞和 动物脑内形成和代谢机理研究中涉及的色谱技术问题。 一、细胞和动物脑内氧化应激水平的评价 在生物样品中，自由基含量非常低、半衰期短，但是它急具毒性，可以袭击芳香族分子 的苯环，其产物可直接经色谱分离和测定。水杨酸(sA)可与-OH反应生成2,3-二羟基苯甲 的。 细胞内脂过氧化程度是衡量细胞内氧化应激程度的一个很重要的标志之一。机体产生的 羟自由基大多能攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧 化物，例如醛基(丙二醛MDA)、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基等新的氧自由基 等。因此，我们建立了MDA的HPLC测定方法并用以反映细胞内脂质过氧化的程度。 二、Salsolinol合成与代谢相关酶的活性测定 5 hi- 甲基转移酶和氧化酶等”。细胞和组织中这些相关酶的分离纯化、活性测定和评价方法研究是 本课题的重要内容。 方法。 N一甲基转移酶是激活Salsolinol细胞毒性的 2．(R)．salsolinolN-甲基转移酶。(R)一salsolinol 甲基转移酶活性检测的定量方法，并成功测定了人血液淋巴细胞、大鼠脑组织中(R)一salsolinol N．甲基转移酶的活性。 检测器)方法，但是关于氧化酶的酶学研究尚未进行。 三、细胞和动物模型中儿茶酚异喹啉的检测与鉴定 1．in 于微渗透膜阻止血细胞、蛋白质、和其他存在于脑内的大分子物质，而容许小分子化合物进 析液的流速在2ul／min。实验中，在导入salsolino120分钟后成功地在透析液中检测到 N-methylsalsolinol。 氟．苯基柱的HPLC．MS方法并用于胞内儿茶酚异喹啉类物质的测定，见下图。经过诱 导的SH—SYSY细胞成功地检测到salsolJnol和N-methylsalsolinM。 胃： i h。 (A) ·i ， 1。 。 j r ■．b潮点_ill,i忆扭撕Il删l，i，一 细胞． 参考文献：(略) 】6