大学生物实验——核酸提取与检测答题.ppt

大学生物实验——核酸的提取与检测 一、实验目的与要求 二、实验原理 细菌（bacteria）为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物。 根据革兰氏染色法，可将细菌两大类：革兰氏阳性菌和阴性菌。两者主要是细胞壁的结构不同。 常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。 二、实验原理 大肠杆菌（Escherichia?coli）是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。 二、实验原理 细菌染色体（chromosome of bacteria）：由一条双股环状DNA分子组成，附着在横隔中介体或细菌膜上。细菌染色体无组蛋白包绕。 细菌染色体上的基因与真核细菌不同，无内含子，转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻译成多肽。 大肠杆菌的DNA双链长达1.1~1.4 mm，是菌体长度的1000倍。 二、实验原理 细菌基因组DNA提取原理: 采用细菌裂解液使细菌裂解，并裂解液中的DNA高效特异性的结合到硅基质离心吸附柱上，而其它污染物可流过膜，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。 纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-TimePCR、文库构建、SouthernBlot、分子标记等下游实验。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳原理： DNA分子在pH8.0的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片段跑在前面。 二、实验原理 溴化乙锭染色法原理： 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色。 在紫外光的照射下，未与核酸结合的EB可被激发出橙红色荧光，在与DNA或双股RNA结合时，荧光强度会增强20倍，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 三、仪器及试剂 1. 仪器及器材 恒温水浴锅、台式离心机、移液器、电泳槽、电泳仪；离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2.试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）、蛋白酶K、无水乙醇、琼脂糖、核酸电泳缓冲液、DNA分子量标准、核酸凝胶上样缓冲液 四、实验步骤 (一)试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA 抽提步骤 1. 取细菌培养物1 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管中，10,000 rpm（~11,500×g）离心1分钟，尽量吸净上清。 2. 向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。 3. 加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，56℃孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。 注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液震荡混匀，室温放置5-10分钟。 4．加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀。加200 μl 无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意：1) 如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入，震荡混匀。 2) 加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。 5．将步骤4所得溶液(包括形成的沉淀)所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。 6．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 7．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7. 8. 12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。 9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Bu