454测序平台研讨.pptx

454测序平台简介 核酸生产中心 2012年3月 E-Learning普及系列课程 课程对象：核酸生产中心员工 课程目的：帮助授课对象了解454测序平台的大致工作原理 学习方式：阅读、自学 参考课时：1小时 温馨提示： 完成本课程的学习有4个条件： 1、浏览完所有的页面； 2、达到测试分数线； 3、浏览完所有的交互页面； 4、在学习中途或完成学习后需要退出课程时，请务必点击学习界面右上角的“退出”按钮退出。 课程简介 课程大纲 1. 454测序平台概述 2. 454文库制备操作流程简介 3. 454乳化PCR流程简介 4. 454测序仪操作和数据质控简介 5. 454的主要项目应用 1.1 454测序系统概述 2005年，454生命技术公司（后被Roche诊断收购）推出基于焦磷酸测序法的高通量测序仪GS 20 System，此举被认为是第二代测序技术进入商品化应用的开端。从2005年至2011年，Roche/454先后推出了GS 20，GS FLX，GS FLX Titanium，GS Junior，GS FLX+等测序仪和试剂版本，数据读长，产能和质量不断上升。目前华大基因所用的454测序仪为2011年中推出的GS FLX+测序平台。 1.2 GS FLX+测序仪系统表现 GX FLX+测序仪 测序试剂版本 XL+ XLR70 最大读长 可达1000bp 可达600bp 读长期望 700bp 450bp 数据产出 ~85%数据量来自读长500bp read ~85%数据量来自读长300bp read ~45%数据量来自读长700bp read ~25%数据量来自读长500bp read 通量 700Mb 450Mb Read产出 1M Shotgun reads 1M Shotgun reads 运转周期 23小时 10小时 2.0 454测序实验流程概述 DNA文库制备 （4小时） 乳化PCR/模板富集 （1天） 测序 （2小时准备，10/23小时上机） 2.1 454快速DNA文库制备流程 末端修复 加A 接头连接 磁珠选择 2.1.1 雾化法打断基因组DNA 如图所示的雾化打断杯，在一个标准大气压（15psi，101.3kPa）氮气雾化打断1分钟，回收打断后DNA并用QIAGEN纯化柱进行纯化。 雾化 2.1.2 DNA的末端修复和加A 末端修复 加A 依赖T4 DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性， 5’-3’外切酶活性和3’-5’外切酶活性补平DNA片段的末端。 依靠T4 PNK酶使得被修复末端5’端磷酸化。 依靠Taq DNA聚合酶使平末端加A 2.1.3 接头连接和片段选择 接头连接 纯化和片段选择 经过末端修复和加A步骤后的DNA片段和带有T尾的Y型分子接头连接形成连接产物，连接产物在Ampure XP磁珠和经过特殊处理的盐溶液共同作用下进行纯化，并筛选掉片段大小低于650bp的DNA片段。 2.2 454快速DNA文库质控 依赖固定在454接头上的FAM荧光标记分子，测定文库的荧光强度，并同线性的标准品浓度曲线进行回归分析判定分子浓度。 T FAM 依靠高灵敏度的Agilent 2100 DNA HS芯片判定PCR-free的DNA文库片段大小分布，尽可能减少650bp以下的小片段对测序的不利影响。 2.3 454扩增子文库实验流程 蓝色序列：454的A,B测序引物序列 红色序列：4碱基的文库key序列用于区分样品和对照序列 金色序列：MID（即index）序列，用于区分不同样品 绿色序列：研究目标区域（如16S rRNA基因可变区，HLA）上下游的保守序列 依照上述图示设计融合引物并对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物使用1.6倍Agencourt Ampure XP beads纯化，即获得所需的扩增子文库用于后续测序。 3.1 454乳化PCR实验流程概述 乳化反应体系制备（2小时） PCR （9小时） 模板磁珠富集（5小时） 通过将固定了测序引物的微珠掺入PCR体系，并和矿物油混合并高速震荡，获得“油包水”的乳化PCR反应体系，理想的乳化PCR反应体系中，每个水滴都是一个仅含有一个微珠和一条模板的独立PCR体系，经过50个循环的扩增后，每个微珠都将生成数十万条固定化的单克隆模板，用于后续的富集和测序。 3.2 通过高速震荡制备乳化PCR体系 使用QIAGEN 组织匀浆机高速震荡使得水相的PCR体系和矿物油充分混合形成油包水的乳化PCR体系。 高倍显微镜下混合完成的乳化PCR体系 3.3 乳化PCR扩增 将乳化的PCR体系等体积分装至96孔板（100μL/孔），在PCR仪上过夜扩增。一般每4个PCR板回收得到的模板珠可满足一个454测序RUN。 3.4 模板珠的富集 空载珠 富集磁珠 模板珠