各类高效液相色谱法.ppt

四、固定相 化学键合相 特点： 不易流失;热稳定性好;化学性能稳定 载样量大;适于梯度洗脱 分类: 非极性键合相：ODS 中等极性键合相：醚基键合相 极性键合相：氨基、氰基键合相 HPLC 概述 1 基本原理 2 各类高效液相色谱法 3 固定相 4 流动相 5 高效液相色谱仪 6 五、流动相 要求： 与固定液不反应;对样品有良好溶解度 粘度小;与检测器匹配 　 溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的R不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，tR改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的R。 五、流动相 洗脱方式: 等度洗脱(isocratic elution) 恒定配比的溶剂系统洗脱 梯度洗脱(gradient elution) 在一个分析周期内不断改变流动相的比例 优点：简便，柱易再生； 缺点：不能用于复杂组分的分离 优点：缩短分析周期；提高分离能力；改善峰形； 增加灵敏度 缺点：基线漂移 五、流动相 HPLC 概述 1 基本原理 2 各类高效液相色谱法 3 固定相 4 流动相 5 高效液相色谱仪 6 六、高效液相色谱仪 输液泵 进样器 色谱柱 检测器 工作站 高效液相色谱仪 HPLC 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 六通阀： 优势：进样量准确，重现性好，可带压进样。 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成 分析柱 φ2-4.6mm L10-25cm 常量柱 φ1-1.5mm L10-20cm 常微量柱 制备柱 φ20-50mm L3-25cm 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 检测器: 紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 检测器: 紫外检测器 优点：灵敏度高，精密度、线性范围好，可 　　　用于梯度洗脱。 缺点： 样品组分应吸收紫外光；要考虑溶剂的极限波长。 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 六、高效液相色谱仪 T/min 波长(nm) 色谱－光谱图 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 检测器: 2.荧光检测器 优点：灵敏度比紫外更高。检测限1×10-10g/ml 缺点：只能用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质 六、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 2489UVD 2414RID 2424ELSD 2465ECD WATERS WATERS 第七节 定性、定量分析 一、定性分析： 1、tR:γ12 —— 相对保留值= 2、化学鉴定：对HPLC流出组分收集，用专属性化学反应对收集 的分离物质组分进行定性。 3、联机技术： HPLC—MS、 HPLC—FTIR 质谱 富利叶转换红外光谱 第七节 定性、定量分析 1、外标法： 以试样的标准品作对照物质，相对比较求含量。 （1）工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液(Ci)s，准确进样，测量峰面积(Ai)s或峰高(hi)s，与(Ci)s绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程，计算样品溶液的含量。 （2）外标一点法：（ 与气相同） 二、定量分析：与气相色谱同。 2、内标法：内标选择同气相。 （1）工作曲线法：在待标准溶液系列中，同体积加入相同量的内标物、进样，分别测出标准物与内标物的A或h，以Ai/As~(Ci)s作图。 （2）内标一点法：在药物分析中，校正因子常常不知，则先配已知浓度标准品，加入一定内标，再将内标按同量加入同体积样品中，分别进样。 （Ci%）样品= 3、校正因子法： 第一步：精称被测组分的标准品mig，加一定精称L内标Msg配液进样。由二者峰面积比求出f；再用待测组分的峰面积与样正因子计算含量。令fs=1 第二步：称一定量样品，加入与测校正因子时相同量的内标物，配液、进样，测出Ai/As。 式中m——称样量 注：用校正因子法时，实验条件必须稳定、波长应重现性好。 小结 熟悉 掌握 了解 HPLC的特点. HPLC的仪器结构及各部件. HPLC中色谱条件的选择. 化学键合相色谱法. 范氏方程在HPLC的表达形式. 分离度影响因素 正相色谱和反相色谱. 作业