抗NI35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达.pdf

中国医科大学 硕士学位论文 抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达 姓名：孙涛 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：王运杰 中文摘要 目 的 抗NI-35抗体(anti-NI-35 拮抗剂对神经再生促进作用的研究是近年的热点。由Bendey等所进行的 一写实验证实了中枢神经系统神经元缺乏再生能力并非其内在特性，而是 由于中枢神经系统髓鞘质本身，少突胶质细胞等强烈抑制轴突的生长，这一 蛋白相关。 研究表明，抗NI-35抗体能促进体内外受损伤神经元的存活和突起生 质脊髓柬后，予2—3周内使断裂轴突再生7一llmm，证实中和髓质相关生 长抑制因子可使轴突于分化的中枢神经系统中再生并延伸，Schwab等证嘎 应用这种抗体在脊髓半切损伤模型中，未损伤侧皮质脊髓束可发出侧芽到 伤的大鼠脑脊髓神经轴突可显著增强其的损伤后再生。这些研究，为临床 治疗DAI提供了实验基础和理论依据。 近年来，抗体治疗应用已成为抗体研究的热点，目前经美国FDA批准 进入临床观察的抗体及抗体片断已达近百种。但随着研究的深入，鼠源性 抗体暴露了其固有的缺陷，由于相对于人体为外源性物质，因此，多次给药 可促进体内免疫球蛋白的亲和性成熟，产生人抗体，引发过敏反应。其次， 完整抗体的分子量可达155KD，在血脑屏障的作用下，如此大的分子量很难 通过毛细血管进入损伤部位。此外，完整抗体由可变区和恒定区构成，其恒 定区即Fc段，除能引起免疫反应外，还可与存在与正常组织的Fc受体结 合，改变抗体在体内的分布，完整抗体的这些结构缺陷限制了他的临床应 用。 scfv)的eDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。它由 抗体分子中构成抗原结合部位的重链可变区和轻链可变区借助一连接短肽 连接而成，由于只保留了V区，免疫源性大大降低，同时由于没有Fc段，不 能与非靶细胞的Fc受体结合，更利于集中到到损伤部位。此外，分子小是 单链抗体的一大优势，目前认为，seFv是能够保持与抗原有效结合的最小 单位。完整抗体在构建为单链抗体以后，其分子量通常只为原有分子的1／ 5或1／6，较小的分子量使其在体内的分布指数较完整抗体有明显升高，更 有利于临床应用。 方 法 适于在大肠杆菌中表达的基因片段。将该基因双链分35个小片段合成，经 退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆载体pUC．18中，经全自动序列 B121，诱导表达。 BL21 分比。 3．按Ni—NTA resin金属亲和层析试剂盒操作程序进行融合蛋白的纯 PH 4．调整蛋白浓度至100ug／ml(加入6M8．0吣)．加入4倍体积复 性液，(20mmol／LTris，250mmol／L 甘肽，02mmol／L氧化型谷胱甘肽，100mmoL／LEDTA)4摄氏度复性24小 时，让后将复性样品转移至截流分子量为8-10KD的透析袋中用透析液 析液一次，透析后样品经100009离心20分钟。将离心后得到的蛋白样品- 20摄氏度保存。Bradford法测定蛋白浓度。 结 果 1．测序结果是合成的基因序列与设计的仅差一个碱基重组子pUCl8／ 744测序结果示：第429位碱基发生突变(C—T)，但并未造成编码氨基酸改 变． ·2· 了良好的生物活性。该蛋白全长278个氨基酸，推测分子量为31kD，SDS． PAGE分析表明，表达的蛋白大小与预期的相符合，在IPTG的诱导下，表达 量随时间的增加而增加，