新型鸡痘病毒重组转移载体的构建.pdf

禽类传染瘸 新型鸡痘病毒重组转移载体的构建 李臻，金宁一，金洪涛，郑敏，付延军，辛苏文 (解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062) I， 摘要：将鸡痘病毒的TK基因分三段经PCR克隆，在每两个片断中间设计酶切位点XhoI和HindllI／Sae 并连入pMD栽体申．由早晚期启动子p7．5控制的筛选标记基因gptCv,d3晚期启动子pL控制的报告基因LBcZ 串联后，克隆到TK基因的Xho I位点之间；将由合成的早晚期启动子pE／L控制的EGFP基因且带有多克 隆位点MCS的部分，克隆到HindlII／SacI之间，构建完成鸡痘病毒重组转移载体． 关键词：鸡痘病毒；载体构建：筛选标记 鸡痘病毒是痘病毒属的成员，它在胞浆内严格复制，且具有宿主限制性，因此已经作为 一种安全有效的非复制型病毒载体，被广泛应用于包括人体在内的哺乳动物疾病防治的疫苗 研发与生产中，其中许多候选重组疫苗已经进入了I、II期临床实验。本实验室早在1994 年就构建了两个鸡痘病毒重组转移载体pUTA．L、pUTA．2，并成功获得了表达HIV基因， 抗肿瘤基因，口蹄疫病毒基因，禽流感病毒多种基因的重组鸡痘病毒，在动物实验中取得了 良好的免疫效果。 但是，国内外的研究发现，目前使用的鸡痘病毒载体存在着一些问题，主要是如何提高 外源基因的表达量和快速有效的筛选出重组子。基于痘苗病毒与鸡痘病毒在基因转录、表达 机制上的相似性，本研究将痘苗病毒强启动予进行了改造，合成了以痘苗病毒启动子为基础 两个早晚期启动子和一个晚期启动子；为了克服TK基因作为筛选标记基因筛选时间长和重 组予不稳定的缺点，引入了大肠杆菌的gpt基因作为重组鸡痘病毒载体的筛选标记；同时为 了检测载体的效率，引入了绿色荧光蛋白作为对照；将筛选标记和报告基因的表达盒置于外 源基因表达盒之外，可以通过二次重组去除重组子中的筛选标记和报告基因，提高了载体的 安全性，也为人及动物用疫苗的生产奠定基础。 1材料与方法 1．1菌种与质粒 (EGFP)基因的质粒pAd．EGFP由刘晓明博士惠赠。 1．2主要试剂 各种内切酶、连接酶购自宝生物工程公司(大连)和Promega公司。基因序列测定在宝生 物工程公司完成。 1．3三个非必需区的克隆 pMD．TKr,pMD．TKm、pMD．TKI三个质粒，并进行序列测定。 1．4载体骨架的获得 用BglⅡ和BBmHI消化pMDWKm，克隆到用BamHI线性化的pMD-TK|下游，获得 质粒pMD—TKIm；用BglII消化pMD-TKr，克隆到同样用BamHI线性化的pMD．TKIm下 游，最终构建载体骨架pMD．TK。 1．5筛选标记表达盒的获得 I单酶切自身环化，去除质粒上SalI的酶切位点。设计PCR引 将质粒pKS．p7．5用Sal 引物上设计的位点克隆到用相同酶消化的pKS-p7．5下游，构建筛选标记表达盒pKS-p7．5一gpt。 510 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 1．6报告基因表达盒的获得 I 和BamH 用EcoV和Ace 1．65kb序列的片段，将其克隆到同样消化的 I消化pAAV-LacZ，回收LacZ pMD．pL．LacZ中，获得完整的pMD．pL．LacZ。 1．7外源基因插入位点的获得 I消化EGFP，克隆到PE／L下游， 克隆在pMDl8-simple上，携带有KS．上的MCS：用Pst 获得质粒pMD．pE／L．EGFP。 1．8鸡痘病毒重组转移载体的构建 用HindIII和Pst 转移质粒pMD．TK．EGFP；用BamHI和SpeI消化质粒pKS．p7．5．gpt，克隆到报告基因表 达盒pL—LacZ下游，构建pKS-pL-LacZ-p7．5-gpt；用salI消化pKS-p