基因操作中大分子的分离和分解.ppt

1-1 第二章 基因操作中大分子的分离和分析 一、DNA的结构及其特性 二、染色体DNA的分离和纯化 三、质粒DNA的分离和纯化 四、DNA的琼脂糖凝胶电泳 五、DNA片段的纯化 六、DNA的浓缩 七、RNA的分离和纯化 八、分子杂交 一、DNA的结构及其特性 1、DNA的组成和结构 1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型，论文发表在《Nature》，获1962年诺贝尔生理学-医学奖。 2、DNA分子的重要特性 变性(denaturation） 指在温度、pH等因素作用下，DNA分子的氢键受到破坏，双链分开的过程。 复性(renaturation) 是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。 带电性 一般pH下，带负电荷，可电泳分离。 水溶解性 DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA的依据。 二、染色体DNA的分离和纯化 真核生物和原核生物细胞的基因组DNA，其分子大小约为103~106 kb。其目的是分离目的基因或基因表达调控因子如启动子以及提供构建染色体载体和染色体基因整合平台等等。 1、材料准备 使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。 大肠杆菌：菌液培养至对数生长期后期 植物：幼嫩的植株或黄化幼苗 动物：肝脏应清除净胆囊 2、细胞裂解 关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤。 细胞裂解缓冲液：防止和抑制内源DNase对DNA的降解 100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 100 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl 3、分离和抽提DNA 根据待提取DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离。 在细胞裂解液中加入适当苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)或氯仿/异戊醇(24:1)等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开。 用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA 。 三、质粒DNA的分离和纯化 1、提纯质粒DNA的三个步骤： 培养细菌 对数生长期的细菌。 收集和裂解细菌：通过离心法收获细菌菌体。 细菌的裂解方法有：非离子型或离子型去污剂、有机溶剂、碱裂解法以及加热处理等。 纯化质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳 CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心法 2、碱裂解法提取质粒DNA的原理 由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，其工作原理广泛适用于微生物质粒的提取。 碱裂解法提取质粒的整个过程主要用到3种溶液，即溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。 核心原理： 在碱性条件下(pH12.0~12.5)线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。 在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。 抽提/裂解缓冲液(具体内容见教材P100-101) 溶液Ⅰ：灭菌后，4℃保存 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ：现用现配，室温下使用( pH12.0~12.5 ) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ：灭菌后，4℃保存，用时冰浴(pH4.6) 5mol/L乙酸钾 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 溶液Ⅰ∶溶液Ⅱ∶溶液Ⅲ = 1 ∶2 ∶ 1.5 3、质粒DNA的纯化 用苯酚/氯仿抽提去蛋白质杂质 一般先按体积比1:1用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)对DNA粗制品进行抽提，然后用1:1氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提 ，以除去蛋白质。 用无水乙醇沉淀浓缩DNA 按体积比2:1用无水乙醇或1:1用异丙醇在酸性条件下（加1/10 体积的3M 醋酸钠，pH5.2）沉淀DNA。 用RNase去除RNA 4、通过试剂盒分离纯化质粒DNA 核心技术：使用一种特制的微型离心纯化柱，在柱中有一种特殊的硅胶膜(silica membrane)。在高浓度盐条件下该膜可以结合多至20μg的DNA，最后用小体积的水或低离子