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植物快速繁殖专题学习 —基本技术 陈 刚 华南师范大学生命科学学院 2005.5 基本技术 实验室设备及器材 培养基及配制 实验操作技术 实验室设备及器材 常用设备 器材 超净工作台 紫外灯 培养架 灭菌锅 电子天平 酸度计 人工气候箱 培养大棚 玻璃器皿 量筒、容量瓶、培养皿、广口瓶、细口瓶、培养瓶、三角瓶、玻璃棒、移液管、滴瓶等 工具 解剖刀、镊子、剪刀、吸耳球、封口膜、酒精灯等 培养基及配制 培养基： 培养基成分（五大类） 植物激素 配制 母液的配制 培养基配制程序 常用培养基配方 ??????? MS 、? B5、 N6及各自特点 培养基 培养基成分大致可以分为五大类，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、植物激素（生长调节剂）。 大量元素 大量元素是指氮、磷、钾、钙、镁、硫等元素。其中氮是培养基中大量需要的。在MS培养基中，以铵态氮的含量为主。磷是生物必需的一种元素，也是作为能源aTP合成所不可缺少的，培养基中以磷酸根(P02—)的形式添加，另外钾、钙、镁、硫等元素，也是植物生长所必需的，这些元素缺乏会产生缺素症，影响酶的活性和代谢。 微量元素 微量元素是植物生命活动不可缺少的。锰、铜、钼、锌等是植物生长所需要的微量元素，MS培养基中经常使用。 铁盐 铁在合成叶绿素中起重要作用，是植物生长不可缺少的金属元素，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。铁盐(FeSO4和FeCl2)在 pH5.2以上常成Fe(OH)2的不溶性沉淀，所以常用以FeS04·7H20和Na2-EDTa结合成的螯合铁。 有机成分 维生素是植物组织培养中经常使用的，有维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等。肌醇对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有促进作用，还可以增强愈伤组织的生长。在组织培养中，大多数情况不能正常进行光合作用，必须在培养基中加糖，作为碳源。同时糖的浓度对调节培养基的渗透压有一定作用。培养基中使用最普遍的是蔗糖，浓度为2～3％。 植物激素 植物激素是植物生命活动中不可缺少的物质，它能促进细胞的分裂生长及诱导器官的分化。组织培养中应用较多的有吲哚乙酸(IAA)；吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6—苄基氨基嘌呤(6-BA)、CPPU、TDZ等。 配制 母液配制顺序是： 用灵敏度为0.1mg的天平称取药品。 往烧杯加入适量蒸馏水或无菌水。 将药品放入烧杯内,并用玻璃棒搅拌使其溶解,难溶时可适当加温以加速溶解。 要待一种药品完全溶解再加入下一种药品 所加入的药品应依次加入，直至药品全部加入溶解为止。 母液装入相应的瓶内，特别是有机成分的母液应该放入4℃冰箱。 培养基配制顺序 取烧杯或三角瓶注入一定量的蒸馏水，将各种母液按所需容积分别用移液管吸取并混合在一起，然后按要求加入一定量的激素、蔗糖后定容至一定体积。 用1mol/L的NaOH或HCl调节pH。 如制固体培养基，则加入1%左右的琼脂后加热煮沸，使其熔化。 分装，可用漏斗将液状培养基注入培养瓶，注入量视培养瓶容量大小而定，通常为容器的1/5左右。 培养基配制顺序 封瓶口。 高压蒸汽灭菌。120℃，1.5Mpa,消毒15～20min。注意压力不能太大，时间也不宜过长，否则蔗糖、有机物特别是维生素类物质会在高温下分解，影响培养基的酸碱度，琼脂也会分解，颜色变深且不易凝固。 灭菌后的培养基可放入接种室内静置，让其降温后凝固，如需斜面可将其斜放。 常用培养基配方 特点 MS培养基特点是无机盐浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较合适，也不需要附加更多的有机附加物。是目前应用最广泛的一种培养基。 特点 B5培养基特点是含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用。从实践中得知，有些植物在B5培养基中生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 特点 N6培养基的特点是成分简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高且不含钼。在国内已广泛用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和组织培养。 实验操作技术 外植体的选择 外植体的灭菌 接种 培养 外植体褐化及防止 玻璃化及预防 外植体的选择 外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。除培养基成分外，决定外植体培养成败的另一重要因素是外植体的来源。再有，不同品种、不同部位之间的分化能力都有巨大差别。 外植体的选择 选择合适