丙二醛MDA测定.doc

丙二醛MDA、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD）的测定 丙二醛MDA测定 测试所需仪器设备： 可见光分光光度计，可调到95℃左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入，用来代替水浴箱）。离心机。 100Ｔ试剂盒组成与配制： 试剂一：液体20mL*1瓶，室温保存．（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。 试剂二：液体12mL*1瓶，用时每瓶加340mL双蒸水混匀，4℃冷藏。 试剂三：粉剂*1支，4℃冷藏。 按规范操作方法来配制MDA3号试剂：将1支100Ｔ的MDA3号粉剂倒入烧杯内加90℃～100℃的热蒸馏水64mL,充分溶解（溶解过程中可适当加热）。冷却后加冰醋酸60mL混匀。 再将上述配好的MDA3号试剂用50％冰醋酸按2：1进行稀释，用多少配多少。 例如您需要用微量法测MDA需要试剂三为15mL，则可以取上述按规范操作法配好的试剂三10mL加冰醋酸5mL，混匀即可。配好的试剂避光4℃冰箱冷藏（冰醋酸自备） 注：因蒸馏水热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加60mL现多加4mL，冷却后在60mL。 　　50％冰醋酸的配制是50mL双蒸水加50mL冰醋酸混合而成的。 　　冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99％以上。 用时将粉剂加入到90℃～100℃的热双蒸水60mL中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至60mL再加冰醋酸60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。冰醋酸自备。 标准品：10nmoL/mL四乙氧基丙烷5mL*1瓶，4℃冷藏。 　　　测试盒冷藏至少可保存一年。 操作步骤： 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管** 10nmoL/mL标准品（mL） a* 无水乙醇（mL） a* 测试样品（mL） a* a* 试剂一（mL） a* a* a* a* 混匀（摇动几下试管架） 试剂二（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 试剂三（mL） 1.5 1.5 1.5 50％冰醋酸（mL） 1.5 旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸40分钟），取出后流水冷却，然后3500～4000转/分，离心10分钟，取上清***，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。 a*表示所取的样品量，标准品量，无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等，例如样品取0.1mL，则标准品、无水乙醇及试剂一也取0.1mL，若样品取0.2mL，则标准品、无水乙醇及试剂一也取0.2mL。因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结果不受影响。 **　一般情况下，标准管、标准空白及测定空白管每批只需做1～2只，若测定管中蛋白量不是太高，则测定空白管可以不测，用标准空白管来代替测定空白管。 ***吸取上清比色时了好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，以免沉淀进入比色皿，影响吸光度。 用此方法，所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响最终结果。 5％组织匀浆a*取0.1～0.2mL进行检测较好。 若发现检测样本吸光主葢低，可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但您的同一课题中MDA的检测都必须延长至80分钟，以免造成批间差异。 此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1mL时，则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.103～0.112。当标准品取样量为0.2mL时，则标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.206～0.224。 计算公式 1.　计算公式： （１）血清中MDA含量计算公式： （２）组织中MDA含量计算公式： *nmol/mgprot为纳摩尔/毫克蛋白 超氧化物歧化酶（SOD）测试盒 100管试剂盒的组成与配制 试剂一：贮备液：10mL*1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用），试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100mL，4℃保存。 试剂二：液体10mL*1瓶，4℃～10℃保存。 试剂三：液体10mL*1瓶，4℃～10℃保存。 试剂四：液体350μL*2支，4℃保存，不可冷冻；4号稀释液10mL*1瓶，4℃保存。 　　　　用时二者按1：14稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4℃保存，不可冷冻。配好后可保存2～3个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。 试剂五：粉剂*１支，用时加70℃～80℃热双蒸水75mL，配好后的试剂避光4℃冷藏。 试剂六：粉剂*1支，用时加蒸馏水75mL溶解后备用，配好后的试剂避光4℃冷藏保存。 显色剂的配制：按照试剂五：试剂六：冰乙酸＝3：3：2的体积比配成显色剂，4℃冷藏。 操作 总SOD(T-SO