血清碱性磷酸酶活性测定讲义.pptVIP

血清碱性磷酸酶活性测定 ————磷酸苯二钠法 主要内容： ⑴ 实验目的 ⑵ 实验原理 ⑶ 实验器材与试剂 ⑷ 实验操作 ⑸ 计算 ⑹ 临床意义 ⑺ 注意事项 酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。 底物减少量或生成物增加量 酶促反应速度= 单位时间 基本概念 实验目的 掌握酶活力测定的一般方法 掌握血清中ALP活力测定方法与临床意义 思考 如何测定酶活力的大小？ 酶活力： 酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。 酶促反应的速度： 常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力测定方法 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 连续监测法： 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 适用于自动生化分析仪 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测 碱性磷酸酶（ALP）是一组在碱性环境中水解磷酸酯的酶类。 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。 什么是ALP？ 实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。 磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林 红色醌亚胺衍生物 ALP pH=10 铁氰化钾 试剂与仪器 器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级标准品。 实验操作 取4支试管，如下操作： 立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C 测定管 标准管 空白管 对照管 血清（ml） 0.100 —— —— —— 酚标准液 —— 0.100 —— —— 蒸馏水 —— —— 0.100 —— pH10碳酸盐缓冲液 1.00 1.00 1.00 1.00 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 底物液 1.00 1.00 1.00 1.00 混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 3.00 3.00 3.00 3.00 血清 —— ——— —— 0.100 计算公式: 参考值: 成人：3~13 Kings单位， 儿童：5~28Kings 单位。 ALP 活力= （A测定—A对照） （A标准—A空白） X 0.05 X 100（kings单位） 临床意义 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。 1. 血清ALP活性升高 肝胆疾病： 阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修