原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
RNA提取及逆转录步骤
组织RNA提取：
1、将标本约100mg放入研钵，立即加入液氮，研碎后，立即加入TRIZOL 1mL，研磨min(清亮)后，转入1.5ml EP管，上下颠倒10次，室温静置5min。标本为组织时， 12000转离心10min取上清，转下步。
2、每加入1ml TRIZOL 在EP管中加入氯仿0.2mL，震荡15s后，静置5min，然后12000转离心15min。
3、将上层水相移入另一EP管中（宁缺毋滥），并加入约0.5mL异丙醇，震荡混匀后静置5min，12000转离心10min.
4、弃上清加1mL 75%乙醇（-20°C预冷），漂浮RNA沉淀，（脾脏需用Tip吹打以去尽杂质），以7500转离心5min。
5、弃上清，置于工作台开风机干燥30min，待RNA沉淀变成半透明时，加入DEPC水20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于55-60度温箱水浴5min左右。-70度保存或立即逆转录。
静脉血RNA提取：
将5mL静脉血于EDTA抗凝管中，放4℃冰箱2h左右；
3000转离心5min，吸取上清置于1.5mL离心管；
加4mL NS于下层血细胞中，吹打混匀以悬浮细胞；
加4mL大鼠淋巴细胞分离液到15mL离心管中，将血细胞悬液缓缓加到装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中；
小心吸取云雾层（即单个核细胞），7500转离心5分钟，去上清；
以1ml NS重悬细胞，吹打洗涤，6500转离心5min，吸尽上清，存于-80℃或加入TRIZOL/裂解液。
逆转录步骤：
1、05.mL EP管中加入
DEPC水 10uL RNA 1uL Oligo 1uL 置于PCR仪中70℃ 5min （编号XIER101）
2、放入冰中5min
3、点离5秒，加入
5×缓冲液 4uL Rnase抑制剂 1uL dNTP 2uL 置于PCR仪中37℃ 5min （编号XIER102）
4、加入逆转录酶1uL，用tip头吹打混匀，放入PCR仪中
42℃60min，70℃10min（编号XIER103），然后-20℃保存。
PCR步骤（25uL体系）：
模板 1uL Sense 1uL Anti-sense 1uL TaqMIX 12.5 uL 去离子水加至25uL
★★ RNA浓度测定：取1uL RNA原液稀释至250uL，测定其A260和A280的值，一般A260/280的比值在1.8-2.0之间满足实验要求
RNA原液浓度=A260×稀释倍数（250）×40（ng/μL）
Western blotting、主要试剂 1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺丙稀酰胺29g+甲叉双丙稀酰胺1g= 100ml，储于棕色瓶，4℃避光保存。 3、Tris-甘氨酸电泳缓冲液30.3gTris，18g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1，得缓冲液。 、转移缓冲液2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，200m甲醇，1L。 、丽春红染液储存液丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。1g考马斯亮蓝R-250用250mL的异丙醇搅拌溶解，再加入100mL的冰醋酸，均匀搅拌，再加入650mL的去离子水，均匀搅拌。滤纸过滤后室温保存。
脱色液 醋酸100mL，乙醇50mL，蒸馏水850mL
恒、g脱脂奶粉+0mL TBS-T（TBS：Tuween=1000：1、一抗（4℃过夜）%脱脂奶粉BS-T溶解）稀释，；TBS-T洗膜10min×3次
、二抗（h）%脱脂奶粉PBS-T溶解）1h，TBS-T洗3×10min，再用BS洗一次，以洗尽吐温。石蜡切片-免疫组织化学
将神经组织切成3-4mm长片段，装入铜条盒，流水冲洗20min
梯度脱水 50%的酒精3-4h）→70%的酒精3-4h）→85%的酒精过夜95%的酒精1h）（同时融蜡，78）100%的酒精1h×2次1半酒精、1半二甲苯透明20min）→二甲苯20min）→二甲苯20min）
二、浸蜡56-58℃（20min）→58-60℃（20min）→60-62℃（60min）
三、包埋 60-62℃包埋（准备电烙铁、镊子）包埋好的蜡块最好放于4℃保存。
四、切片4μm切片，贴片
、脱蜡1、电吹风吹片或烤箱64烤1-2h，至溶蜡；2、入二甲苯（I）中脱蜡5，； 3、入二甲苯（II）中脱蜡10（切片透明），； 4、入100%乙醇（I）5，； 5、入100%乙醇（II）5，； 6、入95%乙醇5；
7、入85%乙醇10min
8、入70%乙醇10min 9、入流水2分钟，甩干水分；
免疫组化 ABC法操作步骤：
（ 1 ） 石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ） 3%H 2O 2
文档评论（0）