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检测大肠杆菌的新型免疫生物传感器研究 陈松月1 张灯1秦利锋1王丽江1YanbinLi2王平．1． 1．浙江大学 生物传感器国家专业实验室 生物医学工程教育部重点实验室 310027 生物医学工程与仪器科学学院 1590信箱杭州 of of 2．DepartmentBiologicalAgriculturalEngineering，UniversityArkamas，USA 摘要：致病性大肠杆茵0157：H7目前已经成为食品安全和人类健康的一个重要威胁，因此，国际 上对大肠杆菌0157：H7进行方便、快捷、准确的在线检测有着广泛的需求．本文介绍了我们研制的一 种用于大肠杆菌快速检测的新型电化学免疫传感器，该传感器采用掺锡的三氧化二铟(m)作为工作电 极，通过硅烷化的表面固定化技术，将抗大肠杆茵0157：H7单克隆抗体固定在ITO电极表面，结合HR．P 酶标记的二抗后，通过酶的催化放大作用在电极表面形成不溶性绝缘性沉淀，通过电化学阻抗谱检测电 荷传递阻抗的变化，实现对大肠杆茵的定量检测．实验结果表明，该免疫传感器的整个检测过程可在 2．4h内完成． 关键词：生物传感器免疫传感器 大肠杆菌检测ITO 1．引言 鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等传播。1982年美国首次报道了由E．coli0157：H7引起的出血性肠炎暴发。 此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势，引起了全世界的关注。05年4月6日，日本 再度发生病原性E．coli E．coli0157：H7，我国亦存在E．coli的散发病例，但尚未有暴发流行的报道。研究发现，只要有lO个Ecoli 0157：H7就足以致病。因此理想的检测方法必须具备的特性为高度敏感、检测下限低或能迅速将细菌数量 扩增到可见出的水平。 常规的检测方法包括细菌分离、增菌、接种等过程，细菌选择和富集需2天～3天，血清特征的生化检 测需4天左右【21。步骤繁琐费时，不利于病情的早期诊断。分子生物学检测技术需要专业的人员、知识和仪 器，不利于在广大基层医疗卫生机构的推广。免疫生物传感器随着国内外的研究发展，已经越来越受到重视。 产生的质量变化转换成频率信号。荧光检测技术可以跟免疫磁性分离技术15】或纳米颗粒[6】结合应用，可大大 提高细菌检测的灵敏度和特异性。流明计可以用在化学发光技术中【7l。 电化学技术在生物芯片和生物传感器中应用也相当普遍。与光学检测技术比较，该技术有助于实现小型 入研究。在叉指金电极阵列上引入特异性抗体【I们，通过抗原抗体的结合反应，可测量叉指电极间的阻抗变化。 电化学阻抗谱法①IS)频率范围广、对体系扰动小，是研究电极过程动力学和电极表面现象的重要手段。 在本文中，介绍了用掺锡的三氧化二铟(哟)作为工作电极，通过硅烷化的表面固定化技术，将抗E．’coli 0157：H7单克隆抗体固定在ITO电极表面，结合碱性磷酸酶标记的二抗后，通过酶的催化放大作用在电极表 面形成不溶性绝缘性沉淀，用循环伏安法(CⅥ和电化学阻抗谱来获得电极界面信息，检测电荷传递阻抗的变 化。 2．实验部分 2．1仪器和试剂 362 过氧化氢(30叭％)．NH40H(30％)，NaH2P04_1-1．290j 0157 化剂有限公司)，甲苯，丙酮(杭州化学试剂有限公司)，乙醇(杭州大征化工厂)，去离子水；抗E．enli 单克隆抗体和抗E。coli 蛋白(BSA)(华美生物工程公司)；麦康凯琼脂和营养肉汤(杭州微生物试剂有限公司)。 2．2纽菌的培养和平板计数 E．coli oC下培养18h，然 0157：H7取自浙江大学动物预防医学研究所，在装有营养肉汤的试管里在37 后用pH7．2的PBS缓冲溶液将细菌依次连续稀释成6个浓度梯度，分别装入6个小离心管。细胞计数用微 h计