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检测机体免疫功能的一种细胞免疫学新技术 ——酶联免疫斑点技术(ELISPOT) 黄彬陈茶综述 姜傥审校 【摘要】酶联免疫斑点技术(ELISPOT)是利用ELISA技术的基本原理从单细胞水平检测分泌 抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞的一种细胞免疫学检测技术，可从单细胞水平评价机体的 细胞免疫或体液免疫功能。近年来ELISPOT技术以其简便、特异、敏感的优点，被广泛用于 肿瘤疫苗评价试验、免疫监测和结核杆菌感染的诊断等方面。本文综述了ELISPOT技术的原 理、基本操作步骤、优缺点和应用等。 【关键词】酶联免疫斑点技术：抗体分泌性B细胞：细胞因子分泌性T细胞 酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospot 本原理从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞的一种细胞免疫学检测技 术，可从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能。ELISPOT不仅适用于特异性T细胞 应答的测定，而且还可用于体液免疫和局部粘膜免疫中特异性B细胞应答的分析。近年来， ELISPOT技术以其简便、特异、敏感的优点，被广泛用于肿瘤疫苗评价试验、免疫监测和结 核杆菌感染的诊断等方面n-2·3·劓。 ELISPOT技术的原理 ELISPOT技术采用类似于ELISA的酶学方法，将抗原或特异性单抗预先包被在贴有 PVDF(聚偏氟乙烯)膜或硝酸纤维素膜的967L微孔板上，将经适量抗原刺激后的免疫细胞加入 微孔中，于379C5％C0：孵箱中孵育，捕获抗原或抗体与免疫细胞分泌出的抗体或细胞因子结 合，将细胞和未结合的成分洗掉后，加入酶标记的单抗或多克隆抗体，与被检测的抗体或细 胞因子结合。加入底物后，可在有相应抗体、细胞因子的位置产生有色斑点，每个斑点代表 一个分泌抗体或细胞因子的细胞n一1。 ELISPOT技术的基本步骤 ELISPOT技术的基本步骤包括：①将适量捕获性单抗或抗原预包被于96：子LELISPOT板上， 用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗3遍，再用含10％胎牛血清(FCS)的培养基封闭， 室温下孵育至少lh。FCS可以封闭所包被抗体的FC受体以 降低非特异性反应。②将细胞样品如外周血单个核细胞(PBMC)、经纯化的CD8+T细胞或去除 [作者单位]510080广州，中山大学附属第一医院检验医学部(黄彬，姜傥)；广东省中医院检验科(陈茶) -686- 板微孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物、提取的抗原等，阴性对照孔中只 p PHA)或阳性多肽。于37C5％C02孵箱 加入培养基，阳性对照孔中加入植物血凝素(2g／ml ④洗6次后，咖入酶底物室温下显色20--30分钟。⑤弃去显色液，用去离子水清洗ELISPOT 板。室温干燥后即可用解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统(如德国Bio—sys生物医疗仪器 公司的Bioreader图像分析仪)计数斑点数。并用斑点形成单位(sfu／L百万加入细胞)记录结 果。每一个斑点代表一个特异分泌细胞因子或抗体的细胞，这样就可以确定样品中抗原特异 性的分泌细胞因子或抗体的细胞数量n列。 目前，使用的检测抗体标记方法和显色系统有生物素、荧光素、碱性磷酸酶和辣根过氧 化物酶显色系统等。显微镜下人工记数显色斑点，由于斑点大小和形状差别很大，结果存在 较大的计数误差。借助计算机成像和图像处理软件，可更准确、快速记录ELISPOT的结果， 尽量减少计数误差。 ELISPOT技术的优缺点 1．优点 ELISPOT技术敏感性高。由于细胞附近的细胞因子浓度高，分泌i00个细胞因子的细胞 也能被发现，足以检测到l／105个IFN—Y分泌细胞。并且因为使用了识别细胞因子或抗体的 两个不同表位的两种单克隆抗体，因而ELISPOT技术有着高度的特异性㈨。 用ELISPOT技术检测新鲜分离及冻存的人的PBMC，发现抗原特异的CD4及CD8细胞的数量 及Thl、Th2型细胞因子产物并不受影响。应用冻存的PBMC可以反复检测多种细胞因子，如TNF一 后的免疫反应嘲。 2．缺点 ①匕BELISA复杂而费时，需严密控制实验条件，操作人员需技术熟练，能对实验结果进