石蜡切片ABC法免疫染色.docVIP

利用ABC kit（Vector）进行石蜡切片免疫染色 Part 1：一抗孵育 （一）：脱蜡亲水 Xylene1－4中浸泡5min，共四次 100％EtOH中浸泡10min，共2次 95％EtOH中浸泡5min 90％EtOH中浸泡5min 80％EtOH中浸泡5min 70％EtOH中浸泡5min 蒸馏水洗涤3次，每次5min （二）封闭非特异性过氧化反应 新鲜0.3％ H2O2 in 甲醇，室温孵育10min 蒸馏水洗涤2次，每次5min Note：时间不可太长，否则也会阻断特异反应 （三）抗原修复 抗原修复液盛在染色缸中，在微波炉中加热至沸腾（约8min），为防止沸腾液体喷出，可在缸中放入切片架子一起加热。 切片浸入已沸的抗原修复液，重新放回微波炉加热至沸腾后，继续加热5min 取出染色缸，自然冷却至水温恢复到室温。 蒸馏水洗涤3次，每次5min Note：1：加热的过程中要盖盖子，以免水分蒸发，抗原修复液的浓度发生改变 2：10X抗原修复液的配制： 15g 柠檬酸钠 2g 柠檬酸 500ml PBS 用时视用量稀释成1X液，1X液的PH值恰为需要的6.0 （四）一抗孵育 将湿盒中放入适量的蒸馏水 （避免切片放入后干掉） 将切片表面的水稍稍甩去，用阻水笔沿标本边缘圈起，要稍稍大于标本的边缘，防止标本边缘干掉 切片 切片放在湿盒中，将稀释好的一抗覆盖在标本表面，用枪头轻柔地吹打混匀，避免气泡 将湿盒放入4度冰箱过夜，或是37度1－2h Note：切片必需保持湿润，不能干掉，否则干掉的样品会呈现非特异显色；但是切片上也不能残留过多水分，会降低抗体浓度，所以，动作要快 Part 2：二抗孵育，显色 （一）二抗孵育 回收或不回收切片上的一抗 切片在蒸馏水中洗涤3次，每次5min 冷冻保存的二抗37度迅速融化，按照1：10的比例加入5％Skim Milk（脱脂奶粉） 甩去切片上残留的水分，立即将二抗覆盖在标本表面，用枪头轻柔地吹打混匀，避免气泡 37度，孵育1h Note: 1：二抗中的5％Skim Milk要在用之前现用现加，脱脂奶粉是为了阻断非特异性反应，现用现加是为了避免阻断二抗的识别反应 2：5％的脱脂奶粉（5g奶粉in100ml PBS）最好新鲜的，配好后在4度保存，超过1周不要再用。 （二）ABC复合物孵育 待距离二抗孵育结束还有30分钟的时候，等量混匀分装好的A液和B液 Note：A液和B液要提前混合在一起反应30分钟 甩去切片表面的二抗，在蒸馏水中洗涤3次，每次5min 以1：10的比例向AB复合物（按照AB复合物的总体积的1/10）中加入5％Skim Milk 甩去切片上残留的水分，立即将AB混合液覆盖在标本表面，用枪头轻柔地吹打混匀，避免气泡 湿盒中37度孵育1h （三）DAB显色 甩去切片表面的AB复合物，用蒸馏水洗涤3次，每次5min 配制DAB工作液：稀释好的D1，D2液等比例混合 甩去切片表面的水，覆盖上DAB工作液，37度孵育5min左右 Note： 1：DAB显色液在37度环境中会很快显色，要每隔2分钟拿出切片在显微镜下观察颜色，一旦达到预期的理想颜色（即特异性染色显示棕色，非特异性背景浅）就立即把切片上的DAB液体吸去，然后将切片放入蒸馏水中洗涤，以终止显色反应。如显色时间过长将会导致切片颜色变黑，非特异性背景增高等后果 2：DAB是一种已知的致癌物质,所以，操作者要注意个人防护，不要污染接触到的物品如显微镜，湿盒等。所以，前述步骤建议将DAB用吸水性的纸或吸泵“吸”去 Part 3: 苏木精复染 切片在蒸馏水中洗2－3次，每次5min 切片浸在苏木素（Hematoxylin）中5－6min 自来水洗几次至水大体无色（注意：自来水不要直接冲刷切片表面，以免损伤标本） 在盐酸酒精溶液中浸一下就转移到蒸馏水中涮洗一次（盐酸酒精溶液：指染色缸中70％酒精中含1到2滴盐酸） 切片转移至约60度（不要低于60度）的热水中约2min，观察至切片颜色呈现色彩适度的紫色 切片移至常温的蒸馏水中洗2－3次，5min/每次 Part4：脱水封片观察 70％酒精，5min 80％酒精，5min 90％酒精，5min 95％酒精，5min 100%酒精，10min，两次 Xylene1－4 5min每次，共四次 封片，观察 附