第一讲基因工程选编.ppt

基因工程（gene engineering） 重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术，人为地改造基因，改变生物遗传性状的系列过程，总称为基因工程。 应用： 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成，生产多肽产品。 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等。 ?定义：指能识别特定的DNA序列并在一定的条件下可在识别位置或附近对DNA 进行切割的酶。 ?限制性内切酶的种类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 限制性活性 + + + 甲基化酶活性 + - + DNA识别序列 + + + 切割特异性 随机 专一 切割位点距识别 位点10-25bP 对ATP依赖性 + - + 对Mg2+依赖性 + + + 蛋白质结构 3种不同亚基 单一成分 2种不同的亚基 2）、产生3‘粘性末末端：如PstI ② 产生平末端： (5).限制性核酸内切酶消化反应的进行 A、限制性核酸内切酶的反应体系： Tris-HCl 50 mM pH7.5 MgCl2 10 mM NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM Volume 20 - 100 μl T，t 37 ℃ ，1 - 1.5 hr 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小 时，完全水解1 μg 标准DNA所需的酶量 B、限制酶消化反应的步骤 以下是对0.2-1.0 mgDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。 a. 将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18ml。 b. 加入2ml适当的10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。 c. 加入1-2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。 d. 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 e. 加入0．5mol／L EDTA(pH8．0)使终浓度达10mmol／L，以终止反应。 C、限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法： a.65℃温浴5分钟。 b.但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液(如加入o．5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。 c.此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。 d.如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。 （6）.影响限制性核酸内切酶活性的因素 1）酶的纯度 2）DNA样品的纯度 蛋白质、氯仿、苯酚、乙醇等均影响酶的活性 3）DNA甲基化的程度 甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性，在基因克隆中使用甲基化酶缺失的菌种制备质粒DNA。 4）酶切反应的温度和时间 大多数酶的最适反应温度为37℃，想缩短时间应加大酶量，若酶量较少可延长时间。 ? 效率：粘性末端平端(100倍)； ? 5，突出3，突出； ?平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI ? ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； ?单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； ? PEG：5%以下可以提高连接效率