病毒学检验第二章鸡胚和动物接种技术-2015讲义.ppt

一般性观察 动物发病症状情况观察 特殊检查 （一）接种后动物观察 * * （二）实验动物的标本采集 大鼠、小鼠采血 剪尾采血 眼眶采血 颈静脉、颈动脉采血 采眼球采血 * * 豚鼠采血 耳缘切口采血 背中足静脉采血 心脏采血 家兔采血 耳缘静脉采血 耳中央动脉采血 颈静脉采血 * 尿液采集 代谢笼法 导尿法 穿刺膀胱法 反射排尿法 腹水采集 胃液的采集 胆汁的采集 胰液的采集 * （三）实验动物的处理 处死 颈椎脱位法 心脏取血法 动静脉大量放血法 吸入法 麻醉法 无害化处理 组织管理 污水 污物 感染动物及有关材料 * 三、使用实验动物的基本原则 研究目的明确 动物选择原则 replace(替代) reduction(减少) refinement(优化) 动物实验科研设计原则 对照原则 重复原则 随机原则 接种物标本的制备和处理 选择含病毒较多的材料作接种物。 固体标本：病人、死者、野生动物及媒介昆虫等的原始标本。 液体标本：患者或动物的血液、脑脊液、尿液、水疱液等标本。 对于含菌标本：需用双抗处理，如鼻液、粪便等。 实验动物选择 选择接种途径 * * 五、病毒学动物实验应注意的问题 病毒学动物实验的安全问题 实验动物自发性病毒感染对实验结果的影响 * 第三节 鸡胚和动物接种技术的应用 病毒分离 病毒鉴定 病毒性疾病发病及免疫研究 抗病毒药物和病毒疫苗效果及安全性检测 疫苗的研制 * 病毒分离方法的比较 方法 应 用 价 值 存 在 问 题 动物接种 应用最早； 方法简便； 结果易于观察 自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题 鸡胚培养 来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种 敏感病毒谱窄 细胞培养 应用广泛，敏感病毒谱广 设备技术要求条件高 * The end 鸡胚是正在发育的活体： 组织分化程度低； 细胞代谢旺盛； 适于许多病毒的生长增殖，尤其是禽类病毒。 鸡胚培养的优点：来源充足； 价格低廉； 操作简单，无需特殊设备； 易感病毒谱较广； 对接种的病毒不产生抗体。 鸡胚培养的缺点：非SPF鸡胚，可能含有某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、支原体、鸡白血病病毒、鸡贫血病毒等。 * 病毒材料直接感染内胚层，也可被鸡胚咽下引起全胚胎感染。病毒被排泄到尿囊腔。在用羊膜腔接种分离病毒时，除。 常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。 可在绒毛尿囊膜上进行上述病毒滴定，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。 可用于上述抗体滴定试验，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。 * 广泛用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养，病毒注射到尿囊腔后，在内皮细胞中复制，释放到尿囊液中。 接种方法 选9－11日龄鸡胚照检后，标出气室边界和胚胎位置，在胚胎面气室上方靠近边界2－3mm处，避开血管作一标记。 用碘酒消毒标记处的卵壳，在标记处钻一孔，再次用碘酒消毒钻孔区，将注射器针头经孔刺入尿囊腔，注入0.1－0.2ml接种物。 将蜡熔化封孔，33℃－35℃孵育48－72小时。每日照检，24小时内死亡的应弃去。 解剖与收获 收获前先将鸡卵置4℃冷冻6－18小时，如急于收获也可将鸡胚置-20℃ 1小时左右。 冷冻后的鸡卵钝端向上置于卵杯上，将气室上方卵壳用碘酒或70%的酒精消毒后去除，暴露壳膜，用无菌镊子小心地将壳膜从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。 用注射器或吸管经绒毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置低温保存。同时做无菌培养。 饲养于温、湿度恒定的屏障系统中， 饲料、垫料、笼具等都要经过消毒处理， 饮水应用高压灭菌或用pH为2.5～2.8的酸化水， 工作人员应换灭菌工作服、鞋、帽、口罩等进入动物室进行操作。 国际上此级动物仅适合于短期或部分科研实验；我国作为科研工作的主要要求的标准实验动物。 以非近亲交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖 4 代以上，称为封闭群，亦称远交群（Outbred Stock）。 ①群体遗传特异性保持相对稳定； ③个体间具有杂合性，存在一定的差异； ③具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成； ④繁殖生产能力较强； ⑤生产成本低，生产量大，供应充足。尽量保持封闭群动物的基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而上升过快。 封闭群动物繁殖方法： 繁殖时，随机的、以非近亲交配方式进行繁殖，保持每代近交系数上升不能超过1%。 1）遗传和表型上的均质性 2）具有杂交优势 3）具有同基因性 4）国际上应用广泛 常用的方法有显微注射法、逆转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子