人类基因组DNA提取探讨.ppt

人类基因组DNA提取 人类基因组 人类基因组是由23对染色体（共46个）所构成，每一个染色体皆含有数百个基因，在基因与基因之间，会有一段可能含有调控序列和非编码DNA的基因间区段。 人类拥有24种不同的染色体，其中有22个属于体染色体，另外还有两个能够决定性别的性染色体，分别是X染色体与Y染色体。 基因组DNA是指生物细胞的染色体DNA，基因组DNA是没有组织特异性的，无论从何种人体组织制得的DNA都是一样的。 人类基因组DNA主要存在于细胞核内，被组蛋白紧密地包装起来组成染色体。 1.真核生物DNA一般存在于细胞核染色体上以及线粒体上，基因组DNA一般又称核DNA。 2.哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。 3.原始材料较少或较难获得时，还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞;有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞。 提取基因组DNA原理 基因组DNA提取主要步骤 一、样品准备： 1.生物组织： （1）最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存- 70℃或液氮 （2）液氮冷冻敲碎研磨 （3）组织匀浆法 （3）液氮匀浆法 2.培养细胞 悬浮生长细胞：1500g离心，4℃10分种收集细胞 单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集 3.血液样品 不同组织细胞基因组DNA提取方法有所不同，分离方法也有所差异，但原理相似，因此他们具有共同的步骤： 二、DNA提取不同方法： 1.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯。 2.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，透析获得DNA。 3.玻璃棒缠绕法：盐酸胍裂解细胞，裂解物铺于乙醇上，用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。 4.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 5.表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。 6.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。 7.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。 三、DNA的浓缩不同方法： 1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量 2.丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。 3.乙醇或异丙醇沉淀：（1）需要阳离子盐的存在，醋酸钠最常用,NaCl对含SDS样品好，NH4Ac去除dNDP好。PiCl沉淀RNA好，但不能用于反转录前。（2）沉淀温度与时间；0℃一4℃，12000g，10分钟，小于100bp DNA需超速离心。 4.精胺沉淀法：与DNA结合后使DNA结构凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。 四、DNA分离纯化总原则 1、保证核酸一级结构完整 2、排除其他分子的污染： 细胞内：蛋白质、糖类、脂类、RNA等 提取过程：有机溶剂、金属离子、外源DNA 基因组DNA提取注意事项 减少化学因素对核酸的降解： 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解： 强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温高压 防止核酸的生物降解： 核酸酶的预防 常用方法： 人类外周血中提取基因组DNA方法 从人全血中提取基因组DNA的方法 人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA方法 无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法 从口腔上皮脱落细胞中提取 实验材料与试剂 材料：人口腔上皮细胞 试剂：抽提缓冲液 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24：1） 75%乙醇、95%乙醇 TE缓冲液 实验操作步骤 取材：用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，咀嚼，用分泌 出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。收集细胞沉淀。 提取与纯化：加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至离心管，混匀，65°C温育30min。 继续 抽提缓冲液：由SDS,EDTA,蛋白酶K组成 SDS：SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的