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广东医学院2003级硕士研究生开题报告 p16在宫颈癌发生中的作用及其机制的研究 研究生： 邓飞 导师： 胡新荣 教授 时间： 2004年10月22日 立题依据 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，其中多个基因的改变导致细胞周期失调，细胞增殖失控在肿瘤形成的过程中发挥了重要作用。 p16基因又称MTS1（多肿瘤抑制基因）是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。 p16在诸多肿瘤中的改变，使它在肿瘤发生中的作用日益受到人们的重视。 一、p16的基因结构和功能 1、p16的基因结构 p16基因定位于9p21，全长8.5kb，由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子的长度分别为126、307、11bp，其cDNA全长450bp。p16基因启动子和外显子1、2含有多个可甲基化的5’－CpG岛。 p16基因编码产物p16蛋白，由148个氨基酸构成，为16kd 2、p16的功能 二、p16与肿瘤 研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。 p16除了调节细胞周期，抑制细胞异常增殖以外，还与肿瘤细胞中端粒酶活性的调节和肿瘤细胞的永生化有关。 大量的实验证据使人们相信在大多数肿瘤中p16扮演者抑癌基因的角色。 三、p16与宫颈癌 宫颈癌是妇女常见肿瘤之一，其发生机制尚不清楚。对于p16与宫颈癌关系的研究，已成为近几年来宫颈癌发生机制研究中的热点。 同在大多数肿瘤中一样。p16基因也被认为在宫颈癌发生中的扮演着抑癌基因的角色，其主要依据有 ： 1、宫颈肿瘤组织中，普遍都能检测到p16基因的失活。 2、p16基因及其编码蛋白在体外实验中能抑制宫颈癌细胞系的生长。 然而，在对p16的进一步研究中，人们用免疫组化检测临床病例标本的p16蛋白表达后发现，p16蛋白的表达会随着宫颈癌病情的进展而呈现逐渐升高的趋势 。 这一发现使人们对p16在宫颈癌发生中的作用产生了疑问： （1）p16在宫颈癌发生过程中起什么作用，是否与在其他肿瘤中一样起着抑癌作用。 （2）如果p16是抑癌基因，为什么其失活率随宫颈癌的发生而逐渐增加的同时，表达也逐渐升高。 以上问题迄今为止，都还没有得到满意合理的解释，国内也缺乏此类相关研究。本实这些验即是针对以上问题展开初步的探讨。 实验目的 1、研究p16在宫颈癌的发生过程的表达趋势。 2、研究p16在宫颈癌发生中的作用及机制。 拟解决的关键问题 1、p16在宫颈癌发生过程中表达是否升高。 2、高表达的p16与cyclinD1竞争性结合CDK4/6的能力是否改变。 3、p16高表达与pRb磷酸化的关系。 4、体外实验中p16表达对cyclinD1与CDK4/6的结合能力及pRb的磷酸化水平的影响。 拟采取的研究方法 （1）IHC （2）CO-IP、IP、western-blot （3）siRNA转染宫颈癌细胞系 技术路线 一、临床实验 1、p16表达的检测： 2、p16功能检测 二、体外实验 预期结果 1、p16在宫颈癌的发生过程中表达逐渐升高。 2、临床实验中，p16高表达组比低表达组，p16与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平升高。 3、体外实验中，转染前后，cyclinD1与CDK4/6的结合增加，pRb的磷酸化水平降低， 进度安排 2004.10－2005.7 临床病理标本的收集。细胞系的筛选，细胞转染及转染后筛选。 2005.8－2006.1 IHC、CO-IP、IP、western-blot。 2006.2－2006.4 结果分析，撰写论文，准备答辩。 经费预算 免疫组化 2000元 免疫沉淀 5000元 Western-blot 3000元 细胞培养 2000元 siRNA转染 25000元* 总计 37000元 * * RB E2F RB P P P P E2F INK4A p16 cyclinD1 CDK4/6 P CDK cyclinD1 CDK4/6 cyclinD1 CDK4/6 CDK4/6 P 竞争性抑制 临 床 病 例 标 本 切片、HE 同一组织来源 不同组织来源 癌前病变 宫颈癌 癌前病变 宫颈癌 p16 P16 的 表 达 趋 势 图像 分析 IHC p16高表达的宫颈癌标本 P16低表达的宫颈癌标本 提取组织块 中的蛋白质 p16-CDK4/6 pRb-P 对比不同组结果，