亚细胞的分离精要.ppt

免疫荧光显微术 Immunofluorescent microscope 荧光显微镜技术是根据标本本身的荧光反应物质具有吸收由荧光源发出的激发光能而呈现荧光的现象，或利用组织及细胞内某成分可与荧光染料结合，并受到荧光激发后呈现出特定颜色荧光的原理，用荧光显微镜进行观察，对待测物质进行定性、定量和定位的技术。 免疫荧光（immunofluorescence，IF）定位是利用抗体与生物分子（抗原）的特异性结合，通过荧光结合抗体对抗原的特异性标记显现图像，从而对标本中的抗原进行定性、定量和定位。由于荧光与标本黑暗的背景对比强烈，所以荧光显微术的灵敏度非常高。荧光强度与激发光的量及荧光染料的量成线性比例关系，因此可以根据镜下荧光强度对标本中的抗原进行定量测定。 目前，免疫荧光显微术已广泛应用于研究胚胎发育、病理组织、癌症及正常细胞表型，植物、真菌、细菌、病毒、亚细胞定位，以及抗原的辅助定位等。 该技术的关键是抗体的特异性、标本的制备、自身荧光、显微镜的使用及操作者。 抗体特异性取决于免疫时用的抗原的纯度，使用亲和纯化的多克隆抗体或单克隆抗体可以获得满意的结果。自身荧光通常限制细胞和组织中荧光抗体探针的可检测性。 通过光谱辨别（spectrum discrimination）可以将自身荧光的影响减至最低。光谱辨别包括选择适当的探针和滤光器以使探针的荧光信号相对于自身荧光之比达到最大。 哺乳动物细胞中自身荧光物质主要是黄素辅酶（FDA和FMN，吸收光波长为450 nm，发射光波长为515 nm）和还原型吡啶核苷酸（NADH，吸收光波长340 nm，发射光波长为460 nm）。 植物的自身荧光物质常是木质素，产生绿色荧光；卟啉，如叶绿素，产生长波长的红色荧光。因此，在IF中使用发射蓝光的短波长荧光染料比较好。对于固定细胞，在抗体孵育前先用含0.1％硼氢化钠的PBS溶液漂洗30 min，可显著地减低自身荧光。 1. 荧光显微镜及其附属设备 荧光显微镜观察是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法一。荧光显微镜由光源、滤片和显微镜三个系统组成。 （一）光源 荧光显微镜的光源系统是应用高压汞灯，该灯能以最小的表面积释放出最大量的短波光源（紫外线）。由启动装置控制，每次启动可工作2～3 h。其使用寿命与启动次数、工作时间密切相关，故在使用时避免频繁启动而损坏电极。 （二）滤片系统 滤片系统包括激发滤片、阻断滤片和吸热滤片。 1．激发滤片：大多以其所表现的光谱基本色调性质命名。 （1）UV激发滤片 激发光通常为波长365～400 nm的紫外线。该滤片适于樱草素（primulin）、硫磺素（thioflavine）、Hoechst 33258及Hoechst 33342等荧光染色观察。 （2）V干涉激发滤片：激发光为波长410～420 nm的紫光。适于单胺类的荧光观察。 （3）BV激发滤片：激发光为波长404～435 nm的蓝紫光。适于吖啶橙及异硫氰酸荧光素（faluorescein isothiocyanate, FITC）标记抗体的免疫荧光染色观察。 （4）B干涉激发滤片：激发光为波长490nm的蓝光。也适于FITC标记抗体的免疫荧光观察。 （5）G干涉激发滤片：激发光为波长520～550 nm。适于四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记抗体的免疫荧光染色观察 。 2. 阻断滤片：在光路中吸收那些经过标本后未被标本转化，吸收而射到视野的激发光，起保护观察者眼睛的作用。激发与阻断滤片配合使用的范围。 3. 吸热滤片：由于光源都含有一定量的红光而产生热量， 此类滤片具有吸收热量的作用。 （三）荧光显微镜 荧光显微镜依照光路照射方向分为透射式和落射式两种。大部分荧光显微镜兼有透射和落射两种功能。通过改变光路中的反光镜可以进行透射光或落射光荧光观察。 2. 抗体标记 抗体与抗原的结合方法：直接法和间接法。 直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。 间接法是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。 图 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图 3. 荧光染料 荧光染料是否发射荧光及荧光的强弱主要决定于该染料的分子结构，同时与其所处的环境及其状态也有密切的关系。如：染色液的pH、浓度和染色时的温度等均对荧光效应有一定的影响。 在进行荧光染色时，还要注意避免与对荧光有淬灭作用的物质接触。例如卤酸盐，碘离子作用最强，其次为溴离子，而氯离子作用最小；金