石斑鱼哈维氏弧菌TS628菌株抗原性研究.pdfVIP

福建霞n 第三届海洋生物高技术论坛 石斑鱼哈维氏弧菌TS．628菌株抗原性研究 覃映雪，王 军木，陈雅芳 (厦门大学海洋与环境学院， 361005，厦门) 哈维氏弧菌是一种能产生单极端鞭毛的革兰氏阴性细菌，是海水鱼虾养殖中常见的致 病菌。该菌引起的病害遍及中国、澳大利距、印度、印度尼西亚、泰国、菲律宾及台湾等国 家和地区的海水养殖业，造成重大的经济损失。国内对哈维氏弧菌的研究多局限于一般的病 原菌分离和常见生物学特征的描述，国外对哈维氏弧菌的研究虽然较为深入，但对其有效抗 原的筛选或相关疫苗的研究报道很少。目前，对哈维氏弧菌病害的防治也尚无有效措施。因 此，有必要加强对哈维氏弧菌致病性和免疫原性的研究，探寻反应良好的抗原成分，为建立 可靠的血清学检测方法矛IlSU备高效疫苗的提供理论依据。本文以从患病石斑鱼分离的病原菌 哈维氏弧菌TS一628菌株为研究对象，分别提取其鞭毛蛋白、外膜蛋白和脂多糖，应用 SDS．PAGE和Westernblot技术分析检测了这儿种主要表面抗原的抗原性，以期为进一步研制 防治哈维氏弧菌病的疫苗提供实验依据． 1材料方法 1．1实验菌株 气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等由鄢庆枇惠赠。 1．2免疫血清的制备 参照《免疫学常用实验方法》，0．2％福尔马林灭活的哈维氏弧菌免疫新两兰大白兔，试 管凝集法测抗血清效价达到l：2000以上，颈动脉采血，分离抗血清，吸附法去除交义反应 冈素，过滤除菌，置．82℃保存备用。 1．3鞭毛蛋白的提取 1 SC．P55H 5min。取上清液经高速离心机(HITACHIHIMAG 5rain，取上清重复55009离心1 centrifuge)40，000ffmin 管分装．20℃保存备刚。 1．4外膜蛋白的提取 参照Nikaido的方法并做适当改进。离心收集菌体，20mmol／L Tris．HCI缓冲液(pH7．2) 148 覆建覆日。 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08。l9-23 剑外膜蛋白沉淀．测定蛋白质浓度后小管分装．20。C保存备用。 1．5 LPS的提取 PBS(50mmol／L pH7．0，含 改进后的Westphal酚水法提取LPS。约59菌体悬浮于20mL 30min，弃沉淀，上清液40，000r／m离心2h，沉淀即为脂多糖． 1．6 SDS．PAGE 鞭毛蛋白和外膜蛋白电泳参照《分子克隆实验指南》，积层胶5％，分离胶15％，电泳采用 Bio．Rad公司mini—PROTEANIITM装置，最后考马斯亮兰(CBB)R．250染色。以低分子量 标准蛋白(Marker)(MBI)的对数值和电泳迁移率绘制标准曲线，计算样品中蛋白的分子量。 积层胶5％，分离胶14％，其中加入尿素至终浓度为4M。电泳完毕后将胶置同定液中I刊定过 夜，0．7％高碘酸的乙醇乙酸溶液中氧化5min，双蒸水洗3遍，每遍15min。放入新鲜配制的 显示明显暗褐色。 1．7 Western印迹 Mini—Protein11 60min；弃去BSA，TBS洗膜3次，每次10min，加适当稀释的抗血清孵育过夜；弃一抗，TBS洗 (0．015％H202)室温显色，水洗终．Il-．反应并拍照记录。 2结果 2．1鞭毛蛋白和外膜蛋白的SDS．PAGE及western印迹 由幽1鞭毛蛋白和外膜蛋白经SDS．PAGE电泳、考马斯亮兰染色结果显示，较为清晰的 鞭毛蚩白条带只有2条，经估算各蛋白的大致分子鼙分别为35kDa、43kDa：而主要的OMP 其中35kDa是最主要的蛋白条带。 幽2看出：用新西兰火白兔抗哈维氏弧菌TS．628株全菌血清进行western免疫印迹分析， 结果