CRISPR系统结构与功能研究进展.doc

CRISPR系统结构与功能研究进展 自然界中的微生物总是通过各种各样的保护机制，使它们能够与恶劣的环境及侵袭性核酸共存。在细菌纲和古细菌纲中发现的规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularlv interspaced short palindromic repeat，CRISPR)CRISPR因其在结构上的特殊性以及功能上的特异性正逐渐成为细菌研究领域的热点。 1.CRISPR系统的发现 Ishino Y等在对大肠埃希菌中的碱性磷酸酶的同工酶Ipa对应的核酸序列进行分析时，发现在该产物编码区的下游存在一个由29个碱基组成的、重复出现的高度保守的核酸序列，两个重复序列之间由长度大致相等的独特的非重复核酸序列间隔开。随后，Mojica F J等在对地中海极嗜盐菌(Haloferax mediterranei)和沃尔卡尼极嗜盐菌(Haloferax volcanii)的研究中发现了类似的结构。随着类似的结构被广泛的发现，直到1991年Hermans P W等才把这种结构正式命SRSR(short regularly spaced repeats)，2002Jansen R改名为CRISPR并一直沿用至今。随着细菌的全基因组测定的完成，已经在90％40％CRISPR位点，更令人惊奇的是在大部分已发现该位点的细菌中含有至少1个CRISPR位点，有的甚至含有2个或3个该位点。 2.CRISPR的基本结构与作用机制 CRISPR基因结构的主体是由同向重复序列(repeat)与间隔序列(spacer)构成的多段R-S结构组成，称为CRISPR基因座(CRISPR locus)，在R-S结构之前，是前导序列(1eader)与一系列的CRISPR相关蛋白基因座(CRISPR-Associated/CAS genes)。CasCRISPR基因座共同构成了CRISPR基因序列。CRISPR基因座和其相关基因能够针对噬菌体感染、质粒接合和转化所造成的基因导入而形成特异性的防御机制，被称为CRISPR干扰。 CRISPR干扰的免疫过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段CRISPR系统会将一段与质粒或噬菌体上基因片段(原间隔序列proto-spacers)同源的短片段DNA插入到前导序列与第一段重复序列之间，每一次插入活动都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的R-S单元，这样使得CRISPR基因座中存在着此种质粒或噬菌体的序列信息，为适应性免疫奠定了结构基础。在表达阶段， CRISPR基因座会被转录成一段长链的CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，这一前体将会在重复序列处被剪切，而后被Cas内切酶加工成小crRNA。成熟的crRNA 会与Cas蛋白结合形成Cas／crRNA作用复合体，在干扰阶段发挥作用。在干扰阶段，crRNA作为Cas／crRNA作用复合体的向导，协助其寻找与其同源的外源核酸靶标，当crRNA与前间区序列互补配对完成时，作用复合体会将靶标降解。 在CRISPR免疫的3个阶段中，适应阶段又可称为信息处理阶段，此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中是高度保守的，主要作用蛋白为Casl和Cas2蛋白；而表达和干扰两个阶段又可被称为执行阶段，此阶段的作用机制在不同的CRISPR系统中有较大的差异性，作用蛋白也有所差别。 CRISPR干扰与RNA干扰(RNAi)极其相似，但是二者在蛋白结构、防御机制、作用靶标等方面也存在较多的不同，而且真核生物会利用RNAi相关通路调节胞内基因表达，而根据目前的报道，CRISPR的功能仅限于防御外源基因。 3. CRISPR系统的分类 cas 基因根据其保守程度可分为核心cas 基因，亚型特异性cas 基因和RAMP( repeat -associated mysterious proteins) 组件基因。cas 基因定位在CRISPR 位点附近，是一个较大的多态性家族，编码的蛋白具有核酸相关的功能域，目前发现有6 个核心cas 基因，它们分别编码核酸内切酶( endonuclease )、核酸外切酶( exonucleases) 和解旋酶( helicase ) 等 cas基因家族是一个较大的多态性家族，由其所表达出的CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，CRISPR—associated proteins)对于CRISPR功能的实现起到了重要作用。cas基因根据其保守程度可分为核心cas基因、亚型特异性cas基因和重复序列相关未知蛋白(repeat-associated mysterious proteins，RAMP)组件基因。核心cas基因包括casl～6基因，其编码蛋白的功能现在已经基本得到验证。Cas3被预测具有解旋酶和核