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人参果抗肿瘤细胞研究(共3338字) 本文 人参PanaxginsengC．A．Meyer为五加科人参属植物，不但其根药用且其茎叶亦供药用，并有广泛的生物学活性，但果实研究较少。课题组近10年的研究表明，人参果含有人参皂苷并具有一定的生物活性，从人参浆果中分离得到人参果总皂苷，经分离鉴定含有异人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、β-谷甾醇和化合物K等12个化合物及5个待鉴定化合物［1、2］。为观察其抗肿瘤活性及机制，我们进行了如下研究。 1材料与方法 1.1材料与试剂人参果总皂苷为五加科植物人参PanaxginsengC．A．Mey．的成熟干燥浆果中提取的总皂苷，由课题组化学组提供。人肺腺癌细胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结肠癌细胞(SW-111C)和人神经胶质瘤细胞(U251)等5个人肿瘤细胞株购自吉林省肿瘤医院;噻唑蓝(MTT)和二甲基亚矾(DMSO)购自美国Sigma公司;RPMI-1640为美国GIBCO产品;胎牛血清(进口分装)、双抗、谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、Hank’液、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)均购自中国协和医科大学细胞中心。二氧化碳培养箱(ESPECBNA-321D型)、倒置显微镜(日本Olympus光学工业株式会社);100级超净工作室(苏州);离心机(北京离心机厂);酶标仪(BioRad560型);透射电子显微镜(TECNAIG2，荷兰)。 1.2细胞培养5种肿瘤细胞株按常规方法培养传代，培养于含10%胎牛血清、2μmol/L谷氨酰胺、100U/L青霉素、100mg/L链霉素RPMI-1640中，37℃、5%CO2培养箱中饱和湿度下培养，取对数生长期细胞用于实验。 1.3人参果总皂苷对5种肿瘤细胞增殖影响取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108L－1接种于96孔培养板，100μL/孔培养24h后，0.5μg/ml的人参果总皂苷，同时设阴性对照组、空白对照组(即只加培养液，不加细胞以调零)及阳性药物组(5-FU)，每组均设4复孔。共同培养48h后，每孔加入20μL的5%MTT，再培养4h弃上清，每孔加入150μL的DMSO振荡10min，应用酶标仪于570nm处测吸光度值(A)。按如下公式计算抑制率:抑制率=(阴性对照A-样品A阴性对照A)×100%。 1.4人参果总皂苷对5种肿瘤细胞电镜形态学观察细胞以每瓶1×106个接种于50mL培养瓶中，培养24h后，加入0.5μg/ml的人参果总皂苷，培养0h、6h、12h、18h、24h和30h后，1500r/min离心5min，收集贴壁及悬浮细胞，细胞沉淀用2.5%戊二醛固定，再用1%锇酸固定后乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察形态改变并拍摄照片。 1.5Westernblot免疫印记法检测人参果总皂苷对相关蛋白表达的影响0.5μg/ml人参果总皂苷分别作用于SPC-A1细胞0h、6h、12h、18h、24h，提取蛋白质进行Western免疫印记法操作，检测周期相关蛋白cyclin及其相关激酶CDK2和CDK1的蛋白表达量。 1.6统计方法实验数据均用SPSS11.0软件进行统计学分析。 2结果 2.1MTT法检测人参果总皂苷对5种人肿瘤细胞增殖的影响表1显示，采用MTT法，人肺腺癌细胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结肠癌细胞(SW-111C)和人神经胶质瘤细胞(U251)等5个人肿瘤细胞株的作用;0.5μg/ml人参果总皂苷作用于5种人肿瘤细胞48h，对5种肿瘤细胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中对SPC-A1细胞的作用最强。 2.2人参果总皂苷对SPC-A1细胞形态学电镜观察电镜下观察，未加药物组细胞形态完整，呈略不规则形，细胞表面微绒毛丰富，核呈不规则形，核仁明显，胞质内可见线粒体，嵴清晰，细胞桥小体使细胞彼此黏附连接成完整的单层细胞;加入0.5μg/ml的人参果总皂苷后，随药物作用时间的延长，细胞呈现凋亡改变，药物作用6h可见细胞表面微绒毛脱落，核小，胞质内部分线粒体肿胀，嵴断裂，有较多溶酶体产生;药物作用12h，细胞表面微绒毛消失，核仁明显，胞质内出现大量空泡状结构;药物作用18h，细胞核内异染色体趋边凝聚呈块状，并可见胞质内髓样小体;药物作用24h、30h，已清晰可见细胞膜包裹细胞器或核片段形成典型的凋亡小体。图1显示，通过上述SPC-A1