1998年AndrewFire和CraigMello等人首次证实双链RNA分子.PDFVIP

RNAi 实验 4 个要素和基本实验路线 RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一 种功能非常强大的工具。不过，开展RNAi 实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi 实验所需的4 大要素一点不复杂： ? 对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA ，shRNA 载体,看实验需要）； ? 适合的转染或者其他将dsRNA 递送进入细胞的方法； ? 适当的对照； ? 检测目标基因表达情况的方法 1. 对应目标基因的 dsRNA 成“RNA 诱导沉默复合物”(RNA-induced 在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长 silencing complexes，RISCs) ，并引导RISCs 双链 RNA(dsRNA) ，在细胞质核酸酶Dicer 的 结合到与之互补的 mRNA 序列上，降解对应 作用下可将长双链 RNA 降解为21-23bp 的小 的mRNA ， 从而导致对应蛋白质水平下降， 分子干扰 RNA(small interfering RNAs ， 最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路 1， siRNAs)，这些小分子RNAs 结合其他元件形 蓝色) 。 生物通 第 7 页 ebioTech特刊RNAI 5年回顾及技术宝典 对于哺乳动物细胞来说，导入 30bp 以上 3 设置适当的参照 的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的 生物通 RNAi 实验特别 ebioTips1： 抗病毒应答反应，此路不通。所以常见的做法 设置好参照：适当的参照对于每个实 是直接制备 19-23bp 左右的 siRNAs，将 验来说都是关键的，必须的，非常重要的。 siRNAs 转入哺乳动物细胞(线路 2 ，红色) ；或 RNAi 实验也不例外。缺少适当的参照，RNAi 者是将短发夹结构 RNA(short hairpin RNAs ， 实验的结果就无从分析。 shRNAs)的DNA 表达载体转入细胞，表达产 未转染细胞对照：不加转染试剂的空 生 shRNA，经过Dicer 切割后得到 siRNA(线 白对照，用于排除转染试剂对细胞活力的影响 路 3，黄色) ；最后 siRNAs 同样和其他元件组 （这个可以在摸转染条件时先做） 合成为 RNA 诱导的沉默复合物 RISCs ，在 空白对照：只加转染试剂(如果实验用 siRNA 指引下识别对应的 mRNA 序列并降解 到载体则可做一组空载体对照) ，用于排除 mRNA ，从而使特定基因表达沉默。线路 1 siRNA 转染对细胞活力的影响 和 2 均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约 3 － 负对照：设置不针对目标细胞内源任 7 天，根据目标基因而异，shRNA 表达载体 何基因的 siRNA 对照，用以排除转染 siRNA 则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能 对基因表达可能造成的任何非特异影响。 缺失基因组筛选研究，也可用于体内 RNAi 正对照：设置针对易于检测的参照基 研究。 因的 siRNAs，用于确证 siRNAs 的递送、转 市面上提供 RNAi 试剂的厂家越来越多， 染以及反应条件环境是可行的。也有建议选择 产品也格外丰富，如何选择呢？生物通参照这 和目标基因同一信号通路的另一个基因作为 3 条主要的 RNAi 实验线路的每个步骤，分别 参照，便于排除脱靶等副反应，以及进一步确 汇集介绍市售好用的相关产品，方便大家实验