12.23号生理实验-超氧阴离子题稿.ppt

植物超氧阴离子自由基含量的测定 一、原理 02—能与羟胺溶液反应生成N02—： NH20H+202—+H+=N02—+H202+H20 N02—+经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色反应生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺(红色)，该红色产物在530nm有专一吸收峰。根据N02—显色反应的标准曲线将A530换算成N02—的浓度，再根据反应式直接进行02—化学计量，得出02—的浓度。 二、仪器设备 分光光度计、高速冷冻离心机、10ml离心管、研钵、恒温水浴锅等。 三、试剂 （1)65mmo1/L 磷酸缓冲液pH7.8 （Na2HPO4:10.69g+KH2PO4:0.9078g/L） ; (2)17mmol／L对一氨基苯磺酸：称2.94g对氨基苯磺酸，加25ml浓盐酸溶解蒸馏水定容到1000 ml; (3)7mmol／L α一萘胺：1.0g α一萘胺，加25mi冰醋酸溶解，蒸馏水定容到1000ml (4)10mmol／L盐酸羟胺: 0.695g/L (分子量69.45) (5)亚硝酸钠标准液：称NaN02(AR级)0.1000g，蒸馏水定容至100ml，摇匀,取5ml用蒸馏水定容到1000ml，即为每毫升含N02— 5μg的标准液。 四、材料 小麦叶片、黑麦草叶片、小白菜、小青菜、荠菜 等 五、方法步骤 1、标准曲线的制作：取7支大小一致的试管编号，按表1顺序添加试剂，每加一种试剂摇动使之混匀。下表： 表1 N02—标准曲线测定反应体系 试管号 试剂(m1) 1 2 3 4 5 6 7 N02— 5 μg标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 对．氨基苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 α一萘胺 2.0 2. 0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 每管N02— μg数 0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10 试剂加完后将各试管置于30oC恒温水浴中保温30min，显色反应后测定A530。以N02— 为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。 标准曲线 2、 02一的提取：黑麦草1.0g→加少量的pH7.8 PBS研磨→定容到10ml→10000r冷冻离心10 min→上清液备用。 3.1 N02— 产生 3. 02一的测定 02一 提取液（ml） 2.0 PBS（ml） 1.5 盐酸羟胺（ml） 0.5 25oC保温20min 3.2 N02—显色 （同标准曲线） 30OC 水浴中保温30min。测定显色液A530值（标准曲线1 号调零）记录测定数据。 （空白：直接用上清液显色，测本底N02—含量） 上述反应液（ml） 2.0 对-氨基苯磺（ml） 2.0 α一萘胺（ml） 2.0 4. 02一含量计算 从标准曲线上查出样品测定液对应的N02一的浓度，并换算成02一的浓度(x)， 按下式计算02一含量： 02一含量(u g．g-1FW)=2X ·Vt·n／(FW．Vs) 式中：Vt--为样品提取液的体积(m1)； n--为测定时样品提取液的稀释倍数； FW--为样品鲜重(g)： Vs--为显色取样品液的体积(m1)； X--为从标准曲线上查得样品液N02一浓度。