基因工程1.2基因工程的操作题稿.pptx

1.2　基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的表达和检测 基因工程的基本操作程序 基因工程的目的基因 　　 与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因 …… 目的基因的概念：目的基因是人们所需要转移或改造的基因,主要是指编码蛋白质的基因。 思考：获取目的基因的方法有哪些？ 1从基因文库中获取 2利用PCR技术扩增 3人工合成 (一)目的基因的获取 1.从基因文库中获取（序列未知） 思考:什么叫基因文库，它包括哪些种类？ 基因文库 基因组文库 部分基因文库－－如：cDNA文库 基因文库 1. 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。 2. 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。 基因文库的构建模式图 通过对 受体菌 的培养而 储存基因 DUCK179制作 3. 基因文库的构建 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 mRNA 反转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 从基因文库获取目的基因 返回 根据目的基因的有关信息，如： 　　基因的已知核苷酸序列； 　　基因的功能； 　　基因在染色体上的位置； 　　基因的转录产物mRNA； 　　基因的表达产物蛋白质； 　　 …… 2.利用PCR技术扩增目的基因 PCR是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 已知基因的核苷酸序列、4种脱氧核苷酸、一对引物、Taq酶 （及缓冲溶液） 原理：DNA双链复制的原理 过程： 变性（90 ℃ －95℃）→退火：引物与单链互补结合（55 ℃ －60℃） →DNA聚合酶作用下延伸（70 ℃ －75℃） 条件：DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、。 2、利用PCR技术扩增（序列已知） 方式:多聚酶链式反应 思考：用PCR技术扩增基因需要哪些条件？ 3. 过程 高温变性（90~95℃） 低温退火（55~60℃） 中温延伸（70~75℃） 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。 多次重复 4.特点：指数形式扩增 3.人工直接合成目的基因 蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的 基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 思考： 1。构建表达载体的目的？ 2.基因表达载体包括哪些必需组分？ 各成分的作用是什么？ （二）基因表达载体的构建 1.构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.构建零件及其作用 1. 目的基因 2. 启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。 3. 终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。 4. 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 （三）将目的基因导入受体细胞 1、转化的概念，将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？ 将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 四、目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。 （一）分子水平 1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 提取受体生 物全部DNA 适当限制 酶切割 DNA片段 用同位素标