9蛋白质的化学修饰题稿.ppt

* 化学修饰的原理 化学修饰的方法学 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 亲和标记 蛋白质化学修饰的应用 内 容 提 要 （第九讲） 三、羧基的修饰 用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。 + + HX + 碳二亚胺 形成相应酰胺 重排 四、巯基的修饰 由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。 常用的有三类： 1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺 2.马来酰亚胺或马来酸酐 3.有机汞试剂 （一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反应。 pH﹥7 碘乙酸 半胱氨酸 副反应： pH﹥5.5 组氨酸 pH=2～8.5 pH=8.5 甲硫氨酸 （二）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团形成的产物则对酸不稳定。 + pH ﹥5 副反应： + pH ﹥7 半胱氨酸 （三）3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与巯基反应。 马来酸酐 + 对氯汞苯甲酸 + S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸 （四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基，它与半胱氨酸形成混合二硫化物。 + pH ﹥6.5 + DTNB 2-硝基-5-硫代苯甲酸 释放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子在412nm处有 吸收，可用光谱法测定其含量。 五、组氨酸咪唑基的修饰 常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。 1-羧乙基组氨酸 3-羧乙基组氨酸 1，3-二羧乙基组氨酸 + pH 4～7 + 焦碳酸二乙酯 碘乙酸 用碘乙酸烷化组氨酸 残基可得单取代或双 取代衍生物。 焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化. 羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。 + pH =7 + 羟胺 六、色氨酸吲哚基的修饰 （一）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。 它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。 （二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化 最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。 应注意 的问题 该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。 试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍生物。 羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。 2-羟基-5-硝基苄基溴 + pH ﹤7.5 + HBr 醋酸 + + H+ + Cl- 对氯硫硝基苯 带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。 七、酪氨酸酚基的修饰 四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团3-硝基酪氨酸。 色氨酸 八、甲硫氨酸甲硫基的修饰 用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。 九、丝氨酸羟基的修饰 甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。 + + 四硝基甲烷 3-硝基酪氨酸 试 剂 修 饰 的 侧 链 Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met 醋酸酐 × × × × 酰基酸酐 × × × 醛 × × × × N-溴琥珀酰亚胺 × × × × 碳二亚胺 × 苯异硫氰 × × 四硝基甲烷 × 三硝基苯磺酸 × 焦碳酸二乙酯 × × 碘乙酸 × × × × 环乙烯亚胺 × × × × 甲苯磺酰氟 × 马来酰胺 × × 常用重要修饰剂的专一性 第四节 蛋白质肽链的交联 双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。 一、设计或选择交联剂要考虑的因素 （一）反应的专一性 交联剂 分为 同型双功能试剂 异型双功能试剂 （二）交联距离 随着交联剂两个功能基之间距离