发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏精要.pptx

菌种的衰退、复壮和保藏 李敏 04.14.2016 ①能在廉价原料上快速生长； ②生长条件易于掌控； ③对设备和操作方式适应性强； ④菌株生产性能稳定性强； ⑤产物产量高，积累浓度高； ⑥产物的回收容易； ⑦抗杂菌、抗噬菌体能力强； ⑧菌体不是病原菌。 发酵菌种的基本要求 (1)微生物保藏单位获取 (2)自然界分离 (3)野生菌株诱变 (4)基因重组 (5)动植物细胞 发酵菌种获得的一般途径 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异 b）污染 c）死亡 一、菌种的衰退 菌种的退化 变异有正变（自发突变）和负变两种，负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。 一、菌种的衰退 衰退的表现 1）原有形态形状变得不典型； 2）生长速度变慢； 3）代谢产物生产能力下降； 4）对外界不良环境的抵抗力下降。 菌种退化现象： 菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等 菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失 菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降 菌种退化的原因 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。突变在数量上的表现依赖于传代旺盛细胞，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多。 菌种衰退的原因 1）基因自发突变（根本原因） 粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens)H-2892 菌株生产力： 18g/L 组氨酸， 五次传代后菌株生产力：4g/L 2）变异菌株性状分离 随着菌种传代和核的分离也会使性状表现多样化，产量也会随之变化，即使是单核孢子发生突变时，如果双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化，经移殖后也会出现性状分离。因此一个较稳定的变异株的获得必须经过多次分离纯化。 菌种衰退的原因 剂量 （以存活率计，%） 菌落总数 突变菌落数 突变频率 （突变菌落/103） 不纯菌落（%） 纯 不纯 100（对照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 0.08 2 27 16.7 22.6 — 43 30 21 13 变异菌株性状分离—— 不同剂量紫外线处理裂殖酵母时不纯菌落百分数 在菌种筛选工作中经常遇到初筛摇瓶产量很高，复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象，在霉菌中更为常见。 3）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占 了优势 个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。 菌种衰退的原因 实验 移接代数 每代斜面保存时间（天） 回复子比数 腺苷产量 （g/L） 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133，14 47，3，9，3，71，14 47，3，9，3，13，58，14 47，3，9，3，13，8，3，47，4 47，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，31 1/4.5×106 1/2.4×106 1/2.2×105 1/3.5×105 1/5.3×103 1/1.0×103 13.5 14.9 10.7 13.1 8.1 7.4 连续传代——产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系 4）与培养条件有关的其它因素——温度、湿度、培养基成分及各种培养条件等。 如在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少。 衰退是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变的过程。 菌种衰退的原因 菌种退化的原因 二、衰退的防止与复壮 1. 减少传代次数 2. 创造良好的培养条件 3. 利用不易衰退的细胞传代 4. 采用有效的菌种保藏方法 （一）防止衰退的措施 （一）防止退化的措施 前期育种时需注意 1.合理的育种，处理细胞用单核的，避免使用多核细胞； 2.增加突变位点，减少分离回复 ； 3.诱变处理后分离纯化，以保证保藏菌种纯； （1）控制传代次数 基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低突变机率。 （一）防止退化的措施 （1）控制传代次数 一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。为此，生产菌种每移植一代，最好同时移植较多的斜面，以供一段时间生产之需，这样移植次数就可减少。