第6章节第四节蛋白质和氨基酸的测定.pptVIP

§6.4 蛋白质及氨基酸的测定 一 概述 二 蛋白质的测定方法 三 氨基酸的测定方法 一 概述 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 蛋白质基本组成单位是氨基酸。 蛋白质是生命的物质基础，蛋白质占人体重量的16.3%，人体11%-13%总热量来自蛋白质。 蛋白质是食品重要的营养成分，是最重要的质量指标，是食品良好色、香、味及品质的保障。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值6.25称为蛋白质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、肉、蛋为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。 二 蛋白质的测定方法 由Kieldhl于1833年提出，凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故至今仍被作为标准检验方法。由于食品中pro含量不同,分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，它们的基本原理都是一样的。 样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 测定过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ①消化 总反应式： 具体操作 具体操作 ①?样品消化：准确称取均匀的固体样品0.5～3g，或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色，继续加热0.5h，冷却至室温。 ②?样品蒸馏：按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。凯氏烧瓶内，加入200ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。 ③ 滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点，蓝色变为灰红色。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。 式中:W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸标准液的浓度，mol/L； V1—空白滴定消耗标准液量，mL； V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； m—样品质量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数。 ③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 说明： ①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴 在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下 消化不完全而造成氮损失。 ④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作为消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑧ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。 3 自动凯氏定氮法 3 自动凯氏定氮法 特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：几分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，又环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150-160℃时，两分子缩合成双缩脲。 方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 甲醛滴定法