MDA多重置换扩增技术题稿.pptx

多重置换扩增（MDA）技术对单细胞基因组测序技术研究进展 北大肿瘤医院病因学教研室 （山东省千佛山医院） 田源 基因测序技术 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法这两种基本思想。 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、成本贵，而且容易出错。 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序（SMS） 基因测序技术 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难度。 单细胞全基因组测序技术：通过一种叫做全基因组扩增技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。 单细胞全基因组测序 单细胞全基因组测序技术：是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。 其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。 全基因组扩增技术 全基因组扩增技术主要分为两种类型： 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等； 一是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置换扩增 (MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增 (pWGA)。 通过MDA扩增DNA 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb?的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’?-5’外切酶活性，错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保证扩增的高保真性。 Φ29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的WGA方法。 目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到的扩增DNA进行测序。 在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。 多重置换扩增（MDA）的示意图： ????????首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA. 模板 引物 引物 多重置换扩增 (MDA) MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10~100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。 但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，往往空白对照样品也总是“无中生有”地产生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。 另外，对测序得到 的大量数据结果的专业分析也是一个重大的挑战。 单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。 多重置换扩增技术（MDA） 多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）的技术： 不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。 整个实验包括： 环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA、DNA测序等。 环境样品的处理 富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细胞。分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处理。如果是水样本，假如对生物体浓度有要求则要考虑附带过滤。 离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。 液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离单细胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中