10第十讲蛋白质的分离纯化教案.ppt

第十讲 蛋白质的分离与纯化 第一节 分离纯化概述 一、分离纯化 保持蛋白质生物活性和化学结构的完整性前提， 将目标蛋白从细胞或组织成分中分离出来的过程。 二、纯化的最终目的 理论上：性质、结构、功能的分析与研究 实践上：满足实际应用的需要，如：诊断试剂、药物、酶等。 三、如何理解分离纯化与分析检测（三个层次） 分析研究的需要——要求对样品进行分离纯化，消除干扰物：如：蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析； 定量分析：消除干扰物质 物质分离纯化过程中离不开分析检测 —定向分离 分离对象的收集，含量、纯度、回收率检测； ——分离过程的控制与管理 分离纯化过程——即是定性和定量检测的过程 如：电泳、HPLC、GC、薄层层析等； 第二节 纯化前处理 预处理 取样或原料：动物组织或植物组织取材、清洗和切割，细胞分离与收集 材料保存条件：一般及时处理、甚至冷冻保存。Why？ 细胞破碎 机械法：匀浆、研磨、压榨（高压细胞破碎仪？）等 物理法：超声波、反复冻融、渗透压 等 化学或生物法：自溶、酶溶、化学渗透（甲苯等）、表面活性剂 等 蛋白质抽提 水、缓冲液、稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提（料液比恰当？温度？pH？） 表面活性剂、有机溶剂（脂结合蛋白）等抽提 抽提蛋白的保护——防酶解、蛋白变性 控制pH、蛋白酶抑制剂、控制温度（低温或高温） 如： EDTA——金属酶 如：二异丙基氟磷酸——抑制酶的丝氨酸活性中心 如：对氯汞苯甲酸——抑制酶的巯基活性中心 第三节 蛋白质的初级分离 （一）沉淀分级： 1、盐析： 盐溶：低盐浓度下，随着浓度升高，蛋白溶解度增大的现象。 盐析：继续提高盐浓度，蛋白溶解度下降并析出的现象。 盐析分级：依据不同的蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同将蛋白分离的过程。 （1）原理（见示意图，p105 ） 蛋白质是一种亲水胶体。盐与水分子亲和，破坏蛋白胶体的水化层，中和蛋白表面电荷，使蛋白分子间聚集而沉淀。（溶解过程？NaCl溶解？） 在一定浓度盐溶液中，不同蛋白质溶解度不同而彼此分离——分级分离。 若在蛋白等电点，沉淀效果更好。 （3）盐类的选择 选择依据：溶解度大，溶解度受温度变化影响小的中性盐 。 如：硫酸盐（铵盐、镁盐和钠盐）、氯化钠、磷酸钠等 常用：硫酸铵；溶解度大，温度影响小（25 ℃ 767g/L，0 ℃ 676g/L） （4）影响因素 蛋白质的种类：种类不同，盐析常数（Ks）不同，所需离子强度不同。 蛋白浓度：合适浓度（2.3-3%），浓度大共沉淀、浓度小蛋白损失严重 pH：蛋白种类不同，pI 不同，接近 pI ，溶解度降低、易于沉淀。 温度：温度升高，蛋白溶解度下降（碰撞几率）；一般在室温操作，对温度敏感的蛋白在0 ℃~4 ℃进行。 2、有机溶剂沉淀法 蛋白质在有机溶剂（水）中的溶解度差异进行蛋白质分级分离的方法 （1）原理 降低溶液的介电常数，增加分子上不同电荷的引力、导致物质溶解度下降 有机溶剂与水作用，破坏蛋白质的水化层、导致蛋白相互聚集 蛋白质种类不同，有机溶剂沉淀浓度不同——分级分离 （2）特点 分辨率比盐析高、沉淀不需脱盐、容易过滤，规模化制备中比盐析应用广泛（多糖、核酸等）。 容易引起蛋白质分子变性而失活，要求低温操作，蛋白和酶的应用不如盐析普遍。 （3）有机溶剂选择 与水互溶；乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈等。 常用：乙醇和丙酮，生产上常用乙醇，甲醇和丙酮有毒性残留。 （4）影响因素 低温：甚至-20℃—— 冷丙酮沉淀蛋白（如：200μl蛋白溶液+1ml冷丙酮） 浓度和pH，与盐析相同 金属离子：多价阳离子（Ca2+、Zn2+）与阴离子蛋白结合成复合物，电荷下降，易沉淀 离子强度：盐浓度太高、太低都不利于分离，以不超过5%，使用乙醇量不超过2倍体积为宜。 操作时，将有机溶剂加到蛋白溶液中，Why？ 3、等电点沉淀法 不同的两性电解质具有不同等电点（pI）。 两性电解质分子上，静电荷为零，溶解度最低。 不同蛋白，pI不同 （1）注意事项： 蛋白与金属离子结合，等电点改变 （2）特点： 沉淀不完全 常用盐析法、有机溶剂法或其他沉淀方法结合使用 4、其他方法 （1）盐复合物沉淀法 金属复合盐法：阴离子蛋白，与金属离子结合形成沉淀，如： 亲羧酸、胺和杂环等含氮类——铜、锌、隔 亲羧酸含氮类—钙、镁、铅 亲硫氢基类—汞、银、铅 重要特性：蛋白—金属离子复合物的溶解度，对溶液的介电常数非常敏感，加入有机溶剂利于蛋白沉淀。 有机酸法：如：苦味酸(2，4，6-三硝基苯酚) 、鞣酸等（）、三氯乙酸 有机酸与分子中含氮功能基团形成复合物 特点：可逆结合—但蛋白易变性，需要加蛋白稳定剂 无机复合盐类：如：磷钨酸盐、磷钼酸盐等 复合物溶解度很低、蛋白极易沉淀析出 金属离子通过H2S