双元表达载体系统.doc

双元表达载体系统 　　双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。 原理 　　1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等 2.双元表达载体系统主要包括两个部分 3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。 4.另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。 5.双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的ir基因可以反式激活T－DNA 的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。 6.外源DNA克隆到微型Ti质粒 T－DNA左右边界序列之间 双元载体标签:?植物双元表达载体 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至植物受体的基因组中。Ti质粒中的2个独立的区域决定DNA转移及整合：T-DNA区(transferredDNA)和vir区(virlence region)。基于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoekema等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA转移到植物细胞基因组中。由于双元Ti载体的体积小而非常便于基因克隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti载体，已成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。 (1))病毒载体系统:植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性?所决定的。以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源荃因整合到植物细?胞基因组中。植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载?体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。?作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。目前己有十几种植物病毒被改造成不同类?型的外源蛋白表达载体中:包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、更豆花叶病?毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX)等。其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有?150种以上。?(2)农杆菌质粒载体系统:质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。r?质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumcfaciens )中，Ri质粒存在于发根农杆菌?(Agxobac[erium tlhixogenis)中。r质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃?本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用五质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA转移?和整合的