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实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。 3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 0.5g肝组织 ＋ 5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后，为核悬液。 另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 离心：2000r/min；10′. 上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细胞核。 核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯化的细胞核。 加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 脱氧核糖核酸的鉴定 水解：取离心管二支，编号，按下表操作 编 号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核 液（ml） - 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 编　　号 1 2 3 细胞质水解液（ml） 2.0 - - 核水解液（ml） - 2.0 - 1mol/L过氯酸（ml）　 2.0 二苯胺试剂（ml） 2.0 2.0 2.0 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色 (595nm) (3)DNA标准曲线的制备 试剂/ml 管号 1 2 3 4 5 DNA标准液 2.0 1.6 1.1 0.6 0.2 0.5M过氯酸 - 0.4 0.9 1.4 1.8 二苯胺试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 [结果分析] 标准曲线法：分别计算细胞质和细胞核中的含量。注意： 样品中DNA含量（ug/g）=水解液中DNA含量x稀释倍数 1