基因工程中细菌内源质粒消除研究进展精要.pptxVIP

基因工程中细菌内源质粒消除研究进展 041214146 艾热帕提·艾合买提 041214153 吴量 041214154 汪洋 041214155 邓传志 041214156 屠以林 一、细菌內源质粒消除 质粒是能够在染色体外自主复制的遗传因子。质粒上携带有多种基因使得细菌具有某些特殊表型。如:抗生素抗性、致病性、代谢能力、共生能力和接合转移等。内源质粒可以自发地从细菌中丢失，但其丢失效率很低。质粒消除是鉴定质粒和获得无质粒的重要方法。 二、消除细菌内源质粒的目的 在研究细菌内源质粒时，为了探究细菌内源质粒的功能，包括细菌耐药性、细菌共生、细菌荚膜形成、细菌的重金属抗性等方面，需要对细菌的内源质粒进行消除。 三、人为干预消除内源质粒的方法 如前面所言，内源质粒可以自发地从细菌中丢失，但其丢失效率很低。为了提高内源质粒的丢失效率，一般采取以下三类方法： 1、物理学方法 2、化学方法 3、分子生物学方法 1.物理学方法 1）特点：通过物理手段消除质粒是最简单的质粒消除方法。其优点是消除实验简单，操作容易且不会对细菌自身的基因组造成影响，不存在突变风险。 2）现在使用物理学手段消除质粒有以下几种： (1)高温 (2)电穿孔法：先用过夜的 E．coli 菌液制备电穿孔细胞，然后将细胞在2.5 kV，25μF 条件下电击，实验发现80%的菌株消除了内源质粒。电穿孔方法消除质粒是因为细菌的细胞膜和细胞壁在高电压下被击穿，表面形成很多孔洞，内源质粒从孔洞流出细胞，造成细菌质粒消除。 (3)原生质体形成与再生法：在金黄色酿脓葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 中利用原生质体形成与再生的方法消除了内源质粒，且消除效率达80%。原生质体形成与再生法消除原理为:在原生质体制备的过程中细菌的细胞壁被去除，造成了质粒复制过程中分配机制的破坏，从而导致质粒消除。 2.化学方法 1）特点：利用化学试剂消除质粒的方法使用最为广泛。该方法消除质粒的作用靶位点主要有两个: 一个与细菌的细胞膜相关，质粒和染色体复制都需要结合在细胞膜上，细胞膜上质粒结合位点的破坏会导致质粒复制受阻，造成内源质粒丢失；另一个与质粒的复制相关，涉及质粒的复制、分配和分离。在复制过程中任何一个环节质粒或者质粒复制所需的酶被抑制，都将导致质粒复制异常，进而造成质粒丢失。 2）方法： （1）吩噻嗪类 吩噻嗪类化合物可以与细菌的DNA结合。在细胞中与细菌DNA的结合效率依次为质粒DNA、线性或者开环质粒、最后为染色体DNA。将质粒 DNA和吩噻嗪类化合物混合进行电泳分析，发现超螺旋的质粒消失，而开环或者线性质粒的比率增加。推测此类化合物结合质粒以后，会在质粒上形成切口，造成质粒解螺旋，从而导致质粒不能复制。 2.化学方法 （2）抗生素类 因为大多数质粒消除试剂都具有抗菌性质，因此抗生素对质粒消除的作用亦被广泛研究。很多抗生素类药物都可用于质粒消除，如新生霉素、曲伐沙星、利福平、丝裂霉素 C 等。其中新生霉素的运用最为广泛，消除效率为4.6%。它们作为DNA促旋酶抑制剂，能抑制促旋酶活性，使得质粒复制中间体在细菌体内大量积累，造成质粒复制异常从而导致质粒丢失。 （3）表面活性剂 表面活性剂如脱氧胆酸、Tween 80、SDS等也被用于质粒消除。其中SDS是最常用的表面活性剂消除试剂。表面活性剂可以溶解膜蛋白，破坏细胞膜，从而破坏细胞膜上质粒复制所必需的结合位点，导致质粒不能正常复制，造成分裂时质粒丢失。 3.分子生物学方法 1)特点：分子生物学消除方法的优点是作用机理和作用靶点明确，消除效率高。 2）方法：主要包括两类:一类为借助转座子消除质粒;另一类为利用质粒不相容性消除质粒。 四、应用实例（1） 谷氨酸非依赖型 γ-PGA 产生菌———解淀粉芽胞杆菌。全基因组测序发现该菌株中含有 1个6758 bp 的内源质粒。为了探明其功能，需要对内源质粒进行消除，采用SDS和吖啶橙结合高温对细菌进行处理，传代多次以后没有检测到质粒消除的突变菌株。选择使用质粒不相容性消除方法，分别将质粒的复制原点和复制蛋白基因连接到温敏型质粒 pKSV7 上，获得不相容质粒 pKSV7rep-ori。利用不相容质粒成功消除了内源质粒 pMC1，消除效率高达93%。 四、应用实例（2） 鉴定根瘤菌质粒功能的方法主要是消除该质粒和将其转移到其他菌株中去以考察其性状的改变。由于大多数根瘤菌质粒