利用不同的方法筛选与鉴定转化子技巧.doc

利用不同的方法筛选与鉴定转化子 院系： 生命科学学院 专业：生物工程 班级：10生物工程一班 姓名： 周伟竞 学号：1014200006 摘要 本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于pET32-CaM5 Vector上带有lacZ基因，因此可以通过菌落直接PCR的分子鉴定，可以鉴定细菌中有没有转入外源DNA；然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小；最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。 关键词 菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定 前言 通过本次的一系列实验操作，目的是为了能够筛选出含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α，并进行鉴定该转化子。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，若要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，则质粒是最好使用的了。因为在实际操作过程中，用重组质粒转化的大肠杆菌DH5α的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。 二、摘要： 利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子。因为不含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α是不能再含有抗生素的培养基上生长的，而含有重组质粒的细菌则能够在该培养基上生长，采用A mp抗性筛选，所以就可以筛选出相应的转化子。然后在进行相应的鉴定试验。对少量的转化大肠杆菌菌体进行PCR反应，进行鉴定，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，观察电泳酶切片段的大小是否与预期的一致。从而达到实验的真正的目的。 三、实验目的： 学习DNA重组技术的关键技术步骤。 把体外的重组的DNA引入宿主细胞中，是具有新的遗传性状，并从中筛选出转化子。 学习电泳法筛选、鉴定重组质粒的方法，通过筛选分析、鉴定出具有所需重组DNA分子的宿主细胞。 四：实验原理： 通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选.只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落. 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物,扩增出特殊目的基因片段,判断所得转化子是否为重组子.但因为PCR技术的高灵敏性,往往会产生假阳性结果.所以有必要进一步进行鉴定. 从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致. 五：实验材料、试剂： 筛选出来的转化子（含pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α） PCR仪,恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,超净台,微量移液枪,1.5mL离心管。 试剂： ①质粒提取试剂：溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L； 溶液II：NaOH溶液（内含1% SDS）：0.2 M； 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） 氯仿 TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）: 20 μg/ml 醋酸铵（pH7.5～8.0）: 7.5 mol/L 异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。 ②酶切试剂：限制性核酸内切酶：HindⅢ（A↓AGCTT） 限制性核酸内切酶缓冲液：10×M Buffer 0.5×TBE Buffer 1%琼脂糖 ③PCR反应试剂： 1.10x PCR buffer 、rTaq 酶 2. dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM 3. 前向引物(10uM)：