利用大肠杆菌生产胰岛素详解.ppt

利用大肠杆菌生产胰岛素 基因工程育种 胰岛素作用机理 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯 一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。 （一）调节糖代谢 胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原分 解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。 促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。 抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。 （二）调节脂肪代谢 胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离 脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛 素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少， 分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化， 进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由 于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸 中毒。 （三）调节蛋白质代谢 胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白 质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有 利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作 用，必须有胰岛素的存在才能表现出来。因 此，对于生长来说，胰岛素也是不可缺少的激 素之一。 （四）其它功能 胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入 细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核 酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。 生产步骤 1.提取目的基因 2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生 1.提取目的基因 既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基 因从原DNA中分离。 1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子 3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运 作…… 2.提取质粒 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提 取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩 增、银染序列分析。 2.煮沸法 3.基因重组 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。 4.将质粒送回大肠杆菌 在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收. 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性， 使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处 于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态）。 5.胰岛素的产生 在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。 * *