基因功能剖析的基本策略.ppt

第十二章 基因功能分析的基本策略 转基因模型是研究基因功能的主要手段 转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。 第一节 转基因技术 转基因技术(transgenic technology)：将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。 一.转基因生物的意义 20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。 二、基本原理 构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。 基本原理 基本原理 基本原理 基本过程 上游—基因改造和载体构建 中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选 1. 上游—基因改造和载体构建 外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。 报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、LUC。 融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。 动物转基因常用的载体 腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。 2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系 基因导入技术：物理、化学和生物学方法 1) 显微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES细胞） 3) 逆转录病毒感染法 4) 精子载体法 1) DNA显微注射法 制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。 DNA 显微注射 DNA 显微注射 DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大，容易辨别。 线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数倍，因而用于显微注射的转入基因通常是去除载体序列的线状 DNA。 DNA 显微注射法的特点 DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。 转入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。 总效率较低(实际成功率1/1000)。 提高显微注射 DNA 表达的成功率 转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。 2) 胚胎干细胞法 胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化特性。 胚胎干细胞法 分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。 胚胎干细胞的分离和培养 胚胎干细胞的分离和培养 胚胎干细胞外源 DNA 的导入 DNA 胚胎干细胞 囊胚 原囊胚 转基因动物 外源 DNA 的整合 用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整合元件, 避免了随机整合。 定点整合位点应选择在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合对细胞正常功能的影响。 定点整合位点必须在基因组的可以进行转录的地方。 胚胎干细胞法的特点 定点整合。 ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。 目前只在小鼠身上获得成功。 3）逆转录病毒感染法 逆转录病毒载体的构建 获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎： 获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养 感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。 逆转录病毒感染法 逆转录病毒感染法的特点 通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段