AKTA简要操作说明.docVIP

AKTApurifier简要操作说明 ? 打开仪器的主电源，打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。 ? Unicorn Manager文件管理、Method Edit方法编辑、System Control系统控制、Evalution结果处理，4个窗口同时打开，同时关闭。 ? Unicorn Manager中Manual运行的结果自动保存在Manualruns的文件夹中，文件名从Manualrun1~Manualrun10，第11个结果会覆盖第1个文件（最多保存10个默认的文件名）。如果手动结果需要长期保存，可以remove到指定文件夹或者rename。可以利用Manual-other-record-on（off）来选择文件夹，制定文件名保存手动结果。 ? 手动命令(Manual)见《?KTA系统手动命令指南》 ? 利用脱盐实验熟悉手动操作(System Control→Manual) 脱盐试验原理：凝胶过滤 (或称分子筛) 层析是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小分离混合分子的技术 。蛋白质是生物大分子，分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、可靠 。由于层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程。Sephadex G-25 介质用带3- 氯-1 ，2- 环氧丙烷(epichlorohydrin) 交联葡聚糖加工成珠状的介质。适合分子量在5000 以下的生物分子的脱盐及缓冲液置换工作。在该实验中，蛋白质是大分子，盐离子是小分子，因此蛋白质先出来（280nm有特征吸收），盐离子后出来（电导值显示） o 样品：5mg/mLBSA，0.5M NaCl溶液 10mL o binding buffer缓冲液：去离子水 o 层析柱：HiTrap Desalting 5 mL o 流速：5mL/min, o 样品体积：200ul/0.5mL/1mL。 操作： 1）准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45micro;m的滤膜过滤，使用前用低频超声脱气10min。 2）清洗及管道准备 首先将A1管道放入binding buffer中，在System Control窗口点击工具栏内的Manual，选择 Pump→Pump wash purifier，选中A1管道为ON， Execute。泵清洗将自动结束。 3）安装层析柱： 在Manual里选择Pump→Flow rate，输入流速5mL/mL，Execute，读取系统空压X Mpa（没有安装层析柱的系统压力），选择Alarmmon→alarm pressure，设置high alarm,输入X+0.3Mpa（填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），Execute。Flow rate，输入流速1mL/mL，Execute，待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。改变Flow rate，输入流速5mL/mL，Execute 4)开始纯化： o 选择检测波长，Alarmmon→Wavelength→UV1,UV2,UV3(可以只打开一个波长280nm)等待柱子平衡好了（观察电导COND，pH的数值和变化趋势）就准备上样了。此时将紫外调零，选择Alarmmon→autozero，Execute。 o 用样品环上(也可在平衡时将样品推入样品环)：将样品吸进注射器，推掉气泡，从InjectionValve的3号位推入，推好后不要取下注射器。在Manual里选择Flowpath→InjectionValve→Inject，Execute。 o 设定收集： 固定体积收集：（如果有出口阀）Manual→Flowpath→outletvalve→F2，insert，选择Frac→Man_fractionation，输入每管收集体积，insert，exectue。结束固定体积收集选择Frac→fractionation_stop，exectue。 峰收集：选择Frac→Peak_fracParametersUV_Level,设定峰收集的参数，insert，选择Frac→Peak_Man_fractionation设定峰收集每管收集的体积，insert，Execute。结束峰收集选择Frac→Peak_frac_stop，Execute。 5）清洗泵及卸下层析柱： 将A1入口放入纯水中，启动Pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。设定Flowrate，alarm pressure，清洗柱子和管路，直至cond~0.1ms/cm