第2章核酸结构与功能范例.ppt

1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 OD260的应用 二、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。 三、DNA的复性与分子杂交 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交(hybridization) DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的DNA分子 核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 探 针 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究核酸和基因诊断的新技术称为探针技术。 探针：单链的核苷酸聚合体标记后，就可以称为探针。 第 五 节 核 酸 酶 Nuclease 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶 依据底物不同分类 DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解DNA。 RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。 依据切割部位不同 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。 核酸外切酶：5′→3′或3′→5′核酸外切酶。 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 核酸酶的功能 核 酶 催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 催化性RNA (ribozyme) 作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。 小 结 DNA的组成与结构及性质 一级：碱基序列 二级：双螺旋结构 三级：核小体、超螺旋等 RNA的组成与结构 mRNA：密码子、5’帽子、3’poly尾 tRNA：三叶草、倒L型结构、反密码子 rRNA：大、小亚基的组装 DNA与RNA的区别：组成、结构、功能 核酸的性质 OD260/OD280 变性与复性 增色效应与减色效应 解链曲线与解链温度 分子杂交与探针技术 DNA和RNA的比较 * * * 碱基互补配对 （二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953） 氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。 （三）DNA双螺旋结构的多样性 二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装 （一）DNA的超螺旋结构 超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(ne