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微生物的实验室培养 （一）微生物分类： 病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物 特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构. 原核生物界 原生生物界 真菌界 病毒界 一、基础知识 细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。 自养菌（autotroph） 异养菌（heterotroph） 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌 单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。 特征： 大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。 功能： 定义： 细菌的菌落 形态各异的菌落 一、基础知识： （二）培养基 ：人们按照微生物对营养物质的不同 要求，配制出供其生长繁殖的营养基质 （1）按物理状态分： （2）按功能分： （3）按成分分： 1.培养基的类型和用途 固体培养基和液体培养基 选择培养基和鉴别培养基 天然培养基和合成培养基 选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 加入青霉素：分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐：分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物 2.培养基内所含的基本物质 (1)水 (2) 碳源 (3)氮源 (4)无机盐 (1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)特殊营养物质 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件 3.培养基内所需的其他条件 (二)无菌技术 1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术包括的四个方面(自学) 3、消毒与灭菌 (1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法：如牛奶的消毒 化学药剂消毒：酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒 防止外来杂菌的入侵 （2）灭菌 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧 注意适用范围 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h 能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿) 高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min 通常用于培养基的灭菌 二、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌） 步骤：计算－称量－溶化－灭菌－倒平板 倒平板 2、纯化大肠杆菌 最常用的是：平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。 微生物的接种技术 平板划线时不能划破培养基，为什么？ 一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 稀释涂布平板法 涂布平板操作 讨论3：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想想，第2步应如何进行无菌操作？ 提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 （三）微生物的恒温培养： 将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录 三、课题成果评价 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同 （一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 菌种的保存： 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法。 四、课题延伸 本课题知识小结 微生物的实验室培养 培养基 无菌技术 制备牛肉蛋