PCR技术及其应用研究报告.pptVIP

DNA的电泳及PCR分析 实验二 孔忠新 2010.12.06 实验目的： 学习并掌握DNA的电泳原理与技术 学习并通过操作掌握基于DNA的聚合酶链式反应（PCR）基本技术 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的EB染色 EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction, PCR “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 —— Korana于1971年 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件： 模板DNA， 寡核苷酸引物， DNA聚合酶， 合适的缓冲体系， DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断； 可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。 PCR技术是生物、医学等领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 变性--退火--延伸 变性：加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 退火(复性)：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 延伸：模板-引物结合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链，这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 图 PCR扩增DNA原理示意图 ①变性（95℃）；②退火；③延伸（72℃） PCR标准反应体系 DNA模板 0.1～2ug 引物 10～100pmol 反应缓冲液 10ul dNTP 各200umol/L 耐热聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L ddH2O 加至 100ul 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 设计引物 1. 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 2. 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3. 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 4. 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 5. 引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6. 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 7. 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 PCR标准反应体系中量的问题 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 模板的量与纯化程度：是PCR成败与否的关键环节之一。 酶及其浓度：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)。 dNTP的质量与浓度：等摩尔配制，遏制错配率，与Mg2＋的浓度比例。 Mg2+浓度：浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件 温度、时间和循环次数 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤设置变性-退火-延伸三个温度点。 三温度点法： 90～95℃变性 再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上 快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 二温度点法 对于较短靶基因(长度为100～300bp时) ，除变性温度外