20160331毕赤酵母表达问答.docxVIP

1. 信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题 1.1 目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列） 1.2 目的蛋白N端可增加氨基酸。则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不出现移码突变就行了。（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。 2. 目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计 2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子； 3. 载体构建问题 3.1 pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的 3.2 pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝）， 3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； 3.4虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； 3.5有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题； 3.6无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； 3.7如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子； 3.8 Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的； 3.9克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）； 3.10测序引物可以用α-fac tor信号引物，也可以用5AOX1引物； 3.11如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。 3.12目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。 4. 毕赤酵母类型选择问题 4.1赤酵母类型 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。 4.2 表达形式与毕赤酵母选择 胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢 (Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。 4.3传代对转化率、表达量等影响 原始酵母菌一定要保存好，传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。 5. 转化质粒问题 5.1转化质粒要求 由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。 5.2转化质粒提纯要求 在线性化之后的质粒